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文献和实验
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库存 :100
英文名 :Goat Pox Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
CAS号 :无
保质期 :1年
供应商 :优利科(上海)生命科学有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :50T
山羊痘病毒(GTPV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
【产品名称】
通用名称:山羊痘病毒(GTPV)核酸扩增检测试剂盒(荧光-PCR 法)Name :Goat Pox Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】48T/盒
【预期用途】
山羊痘是由山羊痘病毒(Goat Pox Virus)引起山羊急性热性接触性传染病,世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。病羊是 主要的传染源,主要通过呼吸道感染,也可以通过损伤的皮肤和粘膜入侵机体。饲养 和管理人员,以及被污染的饲料、垫草、用具、皮毛产品和体外寄生虫等均可称为传 播媒介。在自然条件下,山羊痘病毒只能使山羊发病。本病传播快、发病率高、不同品种、性别和年龄的羊均可感染。本病一年四季均可发生[1-3]。本试剂盒适用于检测山羊皮肤病变组织、淋巴结、水泡液等样本中的山羊痘病毒,用于山羊痘病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对山羊痘病毒特异性引物,结合一条特异性探针[4],用荧光 PCR 技术对山羊痘病毒的核酸进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
核酸提取液 | 1.5mL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
GTPV 反应液 | 1.0mL×1 管 |
GTPV 阳性质控品 | 50μL×1 管 |
阴性质控品 | 250μL×1 管 |
- 不同批号试剂不能混用。
- 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。【标本采集】
山羊皮肤病变组织、淋巴结 5g;水泡液取 1mL。【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。【使用方法】
- 样品处理(样本处理区)
- 样本前处理
-
- DNA 提取
- 对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提取液,100℃恒温处理 10min,13,000 rpm 离心 5min,取上清液转移至新的 1.5mL EP 管,-20℃保存;
- DNA 的提取也可以采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的DNA 提取试剂盒(离心柱提取法),请严格按照试剂盒说明书进行操作。
- DNA 提取
- 试剂配制(试剂准备区)
试剂 | GTPV 反应液 | 酶液 |
用量(样本数为 N) | 20μL | 1μL |
- 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
- PCR 扩增(核酸扩增区)
- 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
- 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
-
- 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
- 结果分析判定
- 结果分析条件设定
-
- 结果判断
可疑:检测通道 Ct 值>35.0,且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
阴性:样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。
- 检测方法的局限性
- 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
- 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
- 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
- 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
- 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
- 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定 量检测不准确的结果;
- 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
- 质控标准
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
【注意事项】
- 所有操作严格按照说明书进行;
- 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
- 反应液应避光保存;
- 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
- 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
- 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
- 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
- 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通 则》进行处理。
【参考文献】
[1] 康文玉, 徐自忠, 高洪等. 羊痘病毒[J]. 中国畜牧兽医, 2004, 31(12):33-36.[2] 陈轶霞. 羊痘诊断技术研究进展[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(34):15008-15009.
- 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2452-2010 绵羊痘和山羊痘检疫技术规范[S].
- 程振涛, 岳筠, 李永明, 等. 山羊痘病毒TaqMan-MGB 荧光定量PCR 检测方法的建立与应用[J]. 生物工程学报, 2009.
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