Quick Cell探针法支原体检测试剂盒

产品描述
Quick Cell探针法支原体检测试剂盒（Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原体特异性引物和支原体特异性荧光探针（报告基因为FAM），用于对样品的支原体基因组DNA进行荧光定量PCR扩增检测。试剂盒内同时含有内参对照质粒mycoIC2和相应的引物和荧光探针（报告基因为VIC），用于监控支原体DNA提取和qPCR扩增的效率。本试剂盒可用于检测一切可能含支原体的样品，比如：体外细胞培养的上清、血清、各种体液（如唾液、尿液、鼻腔分泌物）、别的液体样品。
经多次测试，本试剂盒有记录可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体。根据文献报道，这些支原体基本上占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（M.为Mycoplasma的缩写；A.为Acholeplasma的缩写）。
订购信息

产品名称	产品货号	规格
Quick Cell探针法支原体检测试剂盒	AC16L068	50T

产品组分

产品组分	规格
探针法溶液1P（50T）	550 μL，含支原体和内参检测用引物及荧光探针
探针法溶液2T（50T）	50 μL，酶溶液
内参质粒mycoIC2	500 μL
去离子水	1.2 mL
阳性支原体DNA	50 μL

注：①本试剂盒由于含有内参质粒mycoIC2（用于监控支原体DNA提取和qPCR扩增的有效性），客户可以选择进行样品支原体DNA的提取（内参质粒mycoIC2在支原体DNA提取过程中加入），也可以选择不进行样品支原体DNA的提取（内参质粒mycoIC2在配制体系时加入）。
②本试剂盒的配套仪器可以是任何具有FAM和VIC检测通道的荧光定量PCR仪。
运输与保存
蓝冰运输。-20℃避光保存，有效期60个月。
使用方法

待测样品的前处理

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养2-3d且汇合度在90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，让细胞生长2-3d再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理：
1.1 方法一：对样品进行支原体DNA的提取
很多样品（比如：培养很多天的细胞上清、血清、血浆等）由于含有抑制PCR扩增的成分，如果样品不进行前处理而直接检测，有可能导致qPCR扩增失败（qPCR结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线）。该类样品建议客户进行样品DNA提取（或者离心清洗，见后文方法二）后，再进行检测。提取DNA的过程有两个作用：(1) 基本可以去除所有抑制PCR扩增的成分，保证后续定量PCR扩增的正常进行；（2）具有浓缩支原体DNA的作用，可以提高相对检测灵敏度10-100倍。

1. 方法二：样品不经DNA提取

推荐此方法。该方法不仅可以浓缩支原体从而提高相对检测灵敏度，还可以去除绝大部分可能的抑制物，PCR扩增被抑制的可能性极低。如果该简单一步离心清洗的方法仍然无法去除抑制物，可以使用后文注意事项部分的三步离心清洗的方法。具体方法如下：
(1) 根据浓缩倍数，可以取100 - 1500 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)低速离心5 min，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。
(2) 将上清继续13000 rpm（约16000 g）高速离心10 min，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（样品可以长期保存）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀（如果最初使用了1500 μL的样品，则支原体浓度大约提高了30倍）。
(3) 至此，该样品可以直接进行检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理5 min（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 sec）后，取上清进行检测。
注1:这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清，而是指至少培养2d后的贴壁细胞培养液上清（不需要胰酶消化，也不能取经胰酶消化后的离心上清进行检测）或悬浮细胞培养液。
注2:本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来，从而导致假阴性。
注3:收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃可以长期保存。此外，为了节约检测成本，可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起检测。

荧光定量PCR体系的配制

本步骤所有操作强烈建议使用进口滤芯吸头（比如Axygen滤芯吸头）进行操作，以避免试剂被污染。操作之前，请认真看完后文的注意事项后，再进行操作：
将探针法溶液1P、阳性支原体DNA、去离子水、内参质粒mycoIC2从-20 ℃冰箱中取出，放室温融化（也可以用手握住帮助融化）。探针法溶液1P和探针法溶液2T开盖之前，请高速离心一下（5000 rpm，离心1min）。探针法溶液2T不能在室温长久放置（可以短时间放置5-10min），建议在-20 ℃冰箱直接吸取。
如果样品总数为N（N=待测样品数+1个阳性对照+1个阴性对照），待测样品的前处理方法不同，对应的反应体系也不同，具体如下：
2.1样品进行DNA提取后的反应体系
在DNA提取过程中，必须按说明书加入内参质粒mycoIC2。如果提取时没有加入内参质粒mycoIC2，则按照后文“样品不经DNA提取的反应体系”进行操作：
(1) 反应体系：
表1. 样品经DNA提取后的反应体系

	单个样品体积(μL)	样品总数	总体积(μL)
探针法溶液1P	11	N	11×N×1.06
探针法溶液2T	1	N	1×N×1.06

注：总体积中多配制6%（该比例如果觉得不合适，可以自己调整），是为了防止移液误差，以保证每个反应管中的反应液足量。
例：如果待测样品为8个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为10个。探针法溶液1P的总体积为11×10×1.06=116.6 μL，探针法溶液2T的总体积为1×10×1.06=10.6 μL。
(2) 将上述2种溶液混合，吹打均匀后，按每管12 μL分装到荧光定量PCR八联管中。
(3) 待测样品管加入18 μL提取好的待测样品DNA（样品DNA加入量不能减少，否则内参质粒扩增可能失败）；阴性对照管加入2 μL内参质粒mycoIC2（吹吸均匀后加入）和16 μL去离子水（为防止去离子水被污染，此处建议使用20 μL移液枪配合200 μL吸头进行吸取操作）；阳性对照管加入2 μL阳性支原体DNA（吹吸均匀后加入）和16 μL去离子水。每管反应液的总体积为30 μL。
2.2 样品不经DNA提取的反应体系：
(1) 反应体系：
表3. 内参质粒mycoIC2统一在配制PCR反应体系时加入

	单个样品体积(μL)	样品总数	总体积(μL)
去离子水	14	N	14×N×1.06
探针法溶液1P	11	N	11×N×1.06
探针法溶液2T	1	N	1×N×1.06
内参质粒mycoIC2	2	N	2×N×1.06

注：总体积中多配制6%（该比例如果觉得不合适，可以自己调整），是为了防止移液误差，以保证每个反应管中的反应液足量。
例：如果待测样品为8个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为10个。去离子水的总体积为14×10×1.06=148.4 μL，探针法溶液1P的总体积为11×10×1.06=116.6 μL，探针法溶液2T的总体积为1×10×1.06=10.6 μL，内参质粒mycoIC2的总体积为2×10×1.06=21.2 μL。
(2) 将上述3种溶液混合，吹打均匀后，按每管28 μL分装到荧光定量PCR八联管中。
(3) 待测样品管加入2 μL待测样品DNA，阴性对照管加入2 μL去离子水，阳性对照管加入2 μL阳性支原体DNA（吹吸均匀后加入）。每管反应液的总体积为30 μL。
(4) 盖上荧光定量PCR八联管盖子，去除反应管中的大气泡，3000-6000 rpm离心30 sec。
注：定量PCR八联管的封盖，应该佩戴全新的PE手套进行操作，避免裸手接触定量PCR八联管。

实时荧光定量PCR扩增：

将PCR八联管放入荧光定量PCR仪内，设置如下实时荧光定量PCR扩增程序：
表3. 荧光定量PCR扩增程序

步骤	作用	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	预变性	1 cycle	95 ℃	2 min	否（No）
2	预扩增（不收集荧光）	5 cycles	95 ℃	10 sec	否（No）
2	预扩增（不收集荧光）	5 cycles	60 ℃	35 sec	否（No）
3	正式扩增（需要收集荧光）	40 cycles	95 ℃	10 sec	否（No）
3	正式扩增（需要收集荧光）	40 cycles	60 ℃	35 sec	是（Yes）

注：支原体检测荧光通道选择FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）；内参对照检测荧光通道选择VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）；反应体积（Sample Volume）为30 μL；参考荧光（Passive Reference，只有ABI仪器需要设置）选择None。

结果分析：

4.1 ABI StepOne Plus 荧光定量PCR仪基线和阈值设定方法
其他荧光定量PCR仪的设置大同小异，请参考各自仪器说明书进行设置。
(1) 基线（Baseline）的设定：可以将Auto baseline前面的√ 去掉，然后手动设置基线的起点为2（将刚开始荧光值不稳定的几个循环排除在基线之外。如果起点2不合适，可以适当增减），终点为10左右。
(2) 阈值（Threshold）线的设定：不同通道的阈值应该分别设定。设定某个通道阈值线时，首先选中含阴性对照的若干个样品，去掉仪器勾选的自动Threshold线，将其选项“√ Auto”改为“ Auto”，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照FAM通道扩增曲线（无规则噪音线）的最高点为准。
4.2 实验有效性判断：
阳性对照管：其FAM通道有典型的S型扩增曲线（即指数扩增），其VIC通道的扩增线呈直线或者S型曲线。
阴性对照管：其FAM通道的扩增线呈直线，其VIC通道应该有典型的S型扩增曲线。
如果阳性对照管、阴性对照管同时满足上述条件，则说明本次实验结果有效，否则实验结果无效。
典型的阴性直线型扩增线和阳性S型扩增曲线如图1所示：

图1. 典型的阴性直线型扩增线（左）和阳性S型扩增曲线（右）

4.3 待测样品结果判断：
待测样品有可能出现以下4种组合：
表4. 待测样品管FAM通道和VIC通道可能组合

组合	FAM通道（测支原体）	VIC通道（测内参）	支原体污染判断
1	S型曲线	S型曲线	支原体污染
2	S型曲线	直线	支原体污染
3	直线	S型曲线	无支原体
4	直线	直线	PCR被抑制，结果无效

待测样品管只要FAM通道有S型扩增曲线（组合1和组合2）就说明有支原体污染。因为外加的内参质粒mycoIC2分子数极少，如果支原体含量很大时，内参质粒的扩增会被彻底抑制，导致内参VIC通道无信号（组合2）。
如果待测样品管FAM通道呈直线，而VIC通道有S型曲线（说明样品的DNA提取过程和PCR扩增过程均正常）（由于提取过程中，外加的内参质粒mycoIC2分子数较少，作为内参对照的VIC通道的Ct值会比较大），说明样品无支原体。
如果阳性对照管和阴性对照管结果正常，而待测样品管FAM通道和VIC通道均呈直线，说明PCR被抑制。如果样品是经过提取的，最可能原因是：DNA洗脱前，吸附膜中的乙醇没有挥发彻底（解决方法：洗脱前，将吸附柱放50-65℃烘箱至少15min）。如果样品是没有经过提取的，则样品本身含有抑制PCR的成分（解决方法：将样品进行DNA提取或者离心清洗）。
注1:阳性结果需要结合扩增曲线（主要）和Ct值（次要）进行判断，不能只看Ct值（因荧光值的波动，个别阴性样品虽然扩增曲线基本呈直线，但可能会出现Ct值，此类样品不能判断为阳性。反之亦然：有些样品有S型曲线，但是因为荧光值波动，导致没有Ct值，此类样品不能判断为阴性）
注2:无论FAM通道，还是VIC通道，只要其扩增曲线有明显抬升（呈现S型曲线趋势），即使其Ct值在35-40范围内，该检测结果仍可判断为阳性，可以报告该Ct值。
注3:结果判断完后，将PCR八联管用自封袋密闭后，进行适当处理。
注意事项

本产品主要用于细胞上清支原体污染检测，仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
防DNA污染注意事项：

(1) 强烈建议所有操作（特别是qPCR体系配制步骤和吸取试剂盒中试剂的时候）使用滤芯吸头进行操作，以免试剂被污染。
(2) 必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体。
(3) 样品前处理的各类吸头、离心管，以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头，务必小心处理，请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内，全部样品吸取完后，盖上瓶盖，以防止阳性DNA的挥发，造成环境的污染，进而造成假阳性。整个操作过程，最好不要说话，因为人的口腔和唾液都是带支原体的。
(4) 反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭后，进行适当处理。

实验室必须严格分房间操作（本试剂盒建议在有窗户、通风良好的普通房间内操作，请勿在密闭的房间操作。请勿在细胞培养间进行该步骤的操作，因为细胞培养间支原体污染概率很高）：

试剂配制房间1：专门进行定量PCR体系的配制（建议该房间全部使用进口滤芯吸头。）
DNA提取房间2：专门进行支原体DNA的提取；
DNA加样房间3：专门进行定量PCR体系配制后，添加待测样品、阳性对照、阴性对照等操作；
PCR扩增房间4：进行实时荧光PCR扩增检测。
注：如果房间紧张，可以考虑将房间2、房间3合并在一个房间，而房间1和房间4必须独立。各房间物品（包括移液枪）均为专用，不得交叉使用。

如果出现qPCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时（qPCR结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线），可以采取以下几种措施：

(1) 将取样的时间提前到换液后2 d或3 d，此时细胞上清的PCR扩增抑制物相对比较少，一般不会产生严重的抑制。据我们测试，换液后5 d，PCR扩增抑制物就已经大量积累。
(2) 用PBS对待测样品进行离心清洗，去除样品中的抑制物。具体方法如下：取1 mL细胞上清，先13000 rpm离心10 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次离心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次离心，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 min，简单离心（1000 g，5 sec）后，取上清进行检测。但是该方法有如下缺点：第一，如果样品支原体含量较少，离心清洗可能导致漏检，因为离心清洗过程中，可能导致支原体部分丢失。第二，个别样品，即使经过上述清洗也无法彻底去除抑制剂。
(3) 抽提细胞上清的支原体DNA后再进行PCR鉴定。
(4) 使用李记生物的Quick Cell支原体快速检测试剂盒（细胞培养专用）（货号：AC16L061）或者Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒（货号：AC16L062）进行检测，经测试，未发现这两种试剂盒会被细胞的代谢产物所抑制。为了预防PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题，也可以考虑将所有待测样品全部进行离心清洗或者DNA提取后，再使用本试剂盒进行检测。

支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达107-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7 d后，再进行检测。具体方法请参考李记生物Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒（货号：AC16L062）说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要3-7 d，但是可靠性高。
如何提高本试剂盒检测灵敏度：如果预期待测样品支原体含量较少（比如，低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取以下几种措施：（1）将支原体DNA浓缩提取后再进行检测（提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除），大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。（2）对支原体进行离心浓缩：取1 mL细胞上清，先13000 rpm（约16000 g）离心10 min，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 min，简单离心后（1000 g，5 sec），取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。（3）如果样品是未经提取的，可以通过增加反应管中样品DNA的加入量，比如由原来的2 μL增加到18 μL，如此可以提高检测灵敏度9倍（没有提取纯化或者离心清洗的待测样品，一般不能直接扩大待测样品体积，否则PCR被抑制的可能性将大幅度增加。）
如发现细胞被支原体污染，推荐使用李记生物的Quick Cell支原体祛除预防试剂盒（货号：AC16L066）、EZ 水浴锅抑菌剂（货号：AC16L162）、EZ 细胞房除菌剂（货号：AC16L143）。产品详情可咨销或见官。