乙酰胆碱酯酶acetylcholinesterase，AchE活性测定试剂盒

乙酰胆碱酯酶acetylcholinesterase，AchE活性测定试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：
AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝ji苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝ji苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。

自备仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6mL试剂一，充分震荡溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6mL试剂一，充分震荡溶解。

粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。

测定操作：
1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL上清液、800 μL试剂一、50μL试剂二和50 μL试剂三，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。

乙酰胆碱酯酶acetylcholinesterase，AchE活性测定试剂盒
AchE活性计算公式：
1.组织AchE活性
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T= 245×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/g鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（W ×V样÷V样总）÷T= 245×△A÷W
2.细菌、细胞AchE活性
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T= 245×△A÷细胞数量
3.血清AchE活性
活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T=245×△A
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；V反总：反应体系总体积（L），1 mL=0.001 L；106：1mol=1×106μmol；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；W：样本质量，g；V样：加入上清液体积（mL），0.1 mL；T：反应时间（min），3 min。