线粒体复合体Ⅴ试剂盒

库存 ：99

英文名 ：线粒体复合体Ⅴ试剂盒

保质期 ：12个月

供应商 ：上海酶联生物科技有限公司

保存条件 ：避光 , 低温保存

规格 ：25管/12样

线粒体复合体Ⅴ试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂的组成和配制：
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五：6mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配的定磷试剂应为浅。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆600g，4℃离心5min。
③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。
⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

测定步骤：
1、酶促反应

试剂名称（μL）	对照管	测定管
试剂四	25	25
试剂五	100	100
样本		125

混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min

试剂六	50	50
样本	125

混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液
2、定磷

上清液	170	170
定磷试剂	830	830

混匀，室温静置10min左右，在660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。

线粒体复合体Ⅴ试剂盒
复合体Ⅴ活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
 复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
                         =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
 复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004) 
V反总：反应体系总体积，3×10-4 L； V样：加入样本体积，0.125 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。