碱性蛋白酶Alkaline protease, AKP活性测定试剂盒

库存 ：60

英文名 ：碱性蛋白酶Alkaline protease, AKP活性测定试剂盒

保质期 ：12个月

供应商 ：上海酶联生物科技有限公司

保存条件 ：避光 , 低温保存

规格 ：50管/24样

碱性蛋白酶Alkaline protease, AKP活性测定试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。

测定原理：
在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。



试剂组成和配制：
试剂一：液体90mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10 mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入20 mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。
试剂四：粉剂×1瓶， 4℃保存。临用前加50 mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体1mL×1支，0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2.血清或培养液：直接测定。
3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：
1. 分光光度计预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二、试剂三和试剂四置于40℃水浴保温30min。
3. 对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂二，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g ，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。
4. 测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g ，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5. 空白管：取一支EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6．标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。

碱性蛋白酶Alkaline protease, AKP活性测定试剂盒
计算公式：
1. 按照样本蛋白浓度计算
AKP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min /mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
2．按照样本质量计算
AKP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min /g鲜重）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
3. 按照液体体积计算
AKP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min/mL）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷V1÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）
4.按照细胞数量计算
AKP活性单位定义：30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min /104 cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量
C标准品：0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.5mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），0.1 mL；V2：提取液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min；W：样品质量（g）。

注意事项：
临用前配制的试剂配置后3天内使用完毕。