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文献和实验
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提供商 :江苏集萃药康生物科技股份有限公司
服务名称 :Rosa26-CAG-LSL-Cas9-tdTomato
Rosa26-CAG-LSL-Cas9-tdTomato 验证报告 I
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构建方案
图一 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠构建方案
小鼠的 Rosa26 基因座(Friedrich and Soriano, 1991)被证明能够稳定表达整合到此位点的外源基因,已被广泛地用于制作各种敲入及 Gene Trap 小鼠。我们将 CAG 启动子(Niwa et al., 1991) 驱动的 Cas9 表达元件插入到 Rosa26 位点,并在 CAG 与 Cas9 之间放置两侧带有 loxP 的 STOP 元件,以阻止 Cas9 表达,另外在 Cas9 后面还融合了红色荧光标记 tdTomato,以方便检测Cas9 表达情况。当存在 Cre 重组酶时,Cre/loxP 重组切除 STOP 后即可开启 Cas9 表达,并可以通过红色荧光检测到。
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表达检测
为测试 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠的 Cas9 表达情况及切割活性,我们分离了 MEF 细胞进行体外转染 Cre+sgRNA 测试。将基因型为 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato KI/flper 的 515#雌鼠及 397#雄鼠交配,取 E13.5 天胚胎分离 MEF 细胞,经鉴定确认分离得到的 MEF 细胞基因型为 KI/flper。
我们使用 Lonza Nucleofector™ 2b Device 进行 MEF 转染,转染使用的质粒为 pCAG-Cre:GFP 及U6-GPR50-S51,由于 Cre 与 GFP 融合,Cas9 与 tdTomato 融合,转染后通过观察绿色荧光和红色荧光即可获知 Cre 及 Cas9 的表达情况。转染后,收集细胞,提取基因组 DNA 进行 PCR 检测,通过 PCR 产物 T7E1 酶切实验可以获知 Cas9 对 sgRNA 靶点的切割情况。
转染实验分 5 组(TABLE 1),组 1A-1C 为 Cas9+sgRNA 共转染组,转染的 Cre 及 sgRNA 质粒总量分别为 2ug+4ug, 1ug+2ug 及 3ug+6ug;组 2 只转染 2ug Cre 质粒;组 3 只转染 4ug sgRNA 质粒。
TABLE 1 MEF 电转染实验分组及结果
实验分组 |
转染质粒 |
转染结果 |
|||
pCAG-Cre-GFP |
U6-GPR50-S51 |
绿色荧光 |
红色荧光 |
DNA 切割 |
|
组 1A |
2ug |
4ug |
有 |
有 |
有 |
组 1B |
1ug |
2ug |
有 |
有 |
有 |
组 1C |
3ug |
6ug |
有 |
有 |
有 |
组 2 |
2ug |
0 |
有 |
有 |
无 |
组 3 |
0 |
4ug |
无 |
无 |
无 |
结果显示(图二~七),组 1A-1C 均能观察到绿色荧光和红色荧光,并且,T7E1 检测显示,Cas9
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对 sgRNA靶点进行了明显的切割;组2 能观察到绿色荧光和红色荧光,但未检测到Cas9 对 sgRNA
靶点切割;组3 未检测到绿色或红色荧光,也未检测到Cas9 对 sgRNA靶点的切割。
我们选择18h, 24h,48h 和66h 这4 个时间点观察荧光,发现绿色荧光在18h 最强,随着时间延长渐渐变弱,到66h 已经几乎观察不到;而红色荧光在则在18h 不可见,24h才开始出现,48h最强,66h开始变弱,绿色和红色荧光的变化与Cre 及Cas9 的表达顺序一致,当质粒通过转染进入细胞后,Cre被表达出来即可观察到绿色荧光,Cre切除rosa26 位置的loxP-STOP-loxP,开启Cas9的表达,才可以看到红色荧光,因此,红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现时间晚。T7E1切割检测显示,组2 及组3 都未发生Cas9 切割,证明在缺少Cre 或sgRNA 时,均不会发生Cas9切割。表达检测结果与BROAD 研究所的张锋博士实验室制作的Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 小鼠一致。
图二 T7E1酶切鉴定
T7E1 酶切鉴定结果显示,共转染了Cre和sgRNA质粒的1A1B 1C三组DNA都发生了Cas9对sgRNA靶点的切割,而单独转染Cre 质粒(组2)或单独转染sgRNA 质粒(组3)的两组与B6(阴性对照)一样,未检测到Cas9 切割。
B6: C57BL/6J genomic DNA, W: blank control, DL: DL2000 DNA Marker
图三 组2 Transfectedwith pCAG-Cre:GFP
转染质粒为pCAG-Cre:GFP(2ug),Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光,而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达,出现红色荧光,因此,红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符,绿色荧光18h 即出现,随着时间推移,绿色荧光渐渐消失,至66h 已不可见;24h 开始出现红色荧光,48h荧光增强,66h红色荧光减弱。
图四 组3 Transfectedwith U6-GPR50-S51
转染质粒U6-GPR50-S51(4ug),由于无Cre表达,观察不到绿色荧光,不能切除loxP-STOP-loxP,无法开启Cas9 表达,观察不到红色荧光。实验结果与预期相符,未观察到荧光。
图五 组1A Transfectedwith pCAG-Cre:GFP(2ug)+U6-GPR50-S51(4ug)
转染质粒为pCAG-Cre:GFP(2ug)+U6-GPR50-S51(4ug),Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光,而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达,出现红色荧光,因此,红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符,绿色荧光18h 即出现,随着时间推移,绿色荧光渐渐消失,至66h 已不可见;24h开始出现红色荧光,48h荧光增强, 66h红色荧光减弱。
图六 组1B Transfectedwith pCAG-Cre:GFP(1ug)+U6-GPR50-S51(2ug)
转染质粒为pCAG-Cre:GFP(1ug)+U6-GPR50-S51(2ug),Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光,而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达,出现红色荧光,因此,红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符,绿色荧光18h 即出现,随着时间推移,绿色荧光渐渐消失,至66h 已不可见;24h开始出现红色荧光,48h荧光增强, 66h红色荧光减弱。
图七 组1C Transfectedwith pCAG-Cre:GFP(3ug)+U6-GPR50-S51(6ug)
转染质粒为pCAG-Cre:GFP(3ug)+U6-GPR50-S51(6ug),Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光,而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达,出现红色荧光,因此,红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符,绿色荧光18h 即出现,随着时间推移,绿色荧光渐渐消失,至66h 已不可见;24h开始出现红色荧光,48h荧光增强, 66h红色荧光减弱。
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结论
分离rosa26-LSL-Cas9-tdTomato小鼠的MEF 细胞在体外转染Cre 表达质粒,该模型可在Cre/loxP切除STOP 元件后开启Cas9 及tdTomato表达;在共转染Cre 表达质粒及guide RNA表达质粒时,可同观察到红色荧光,并检测到靶基因的切割。根据实验结果,可判定该模型制备成功。但是,由于转染效率较低,本次实验观察到的荧光信号较弱。
参考文献
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