提供商 ：江苏集萃药康生物科技股份有限公司

服务名称 ：BALB/cJGpt-Pdcd1em1Cin(hPDCD1)Ctla4em1Cin(hCTLA4)/Gpt

BALB/c-hPD1/hCTLA4

品系名称：BALB/cJGpt-Pdcd1^{em1Cin(hPDCD1)}Ctla4^{em1Cin(hCTLA4)}/Gpt

品系类型：Knock-in

品系编号：T003720

背   景：BALB/cJGpt

 

一、品系描述

PDCD1(Programmed cell death1)即程序性细胞死亡受体1，免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。以PD1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植排斥反应等均有重要的意义。

大量研究证实，肿瘤微环境中的肿瘤细胞表面PDL1增高，同时与活化的T细胞上的PD1结合，传递负调控信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡或免疫失能，从而抑制免疫反应，进而促使肿瘤细胞的逃逸。用抗体阻断PD1/PDL1信号通路已成为肿瘤免疫治疗的经典方法^[1-3]。

细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）又名CD152，是由CTLA4基因编码的一种白细胞分化抗原，属于免疫球蛋白超家族。CTLA4基因编码膜蛋白，其胞外区为受体/配体结合区，胞内区负责信号传导。T细胞中主要表达CTLA4的细胞为调节性T细胞（Treg），一类可以负向调节细胞免疫的T细胞。目前认为CTLA4的功能为控制Treg定位。CTLA4的胞外区能够与CD28竞争性的结合APC表面的B7分子配体（CD80/CD86），产生抑制信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA4的免疫效应可刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应^[4-5]。

集萃药康采用基因编辑技术自主研发了BALB/c-hPD1/hCTLA4人源化小鼠模型。该模型可用于人类PD1抑制剂、CTLA4抑制剂以及两者联用的药效评价及安全性评价。

二、应用领域

1、人CTLA4抑制剂药效评价或人PD1抑制剂。

2、人CTLA4抑制剂及人PD1抑制剂联合用药药效。

3、人CTLA4抑制剂及人PD1抑制剂毒理学评价。

4、抗肿瘤研究。

5、自身免疫病研究。

三、验证数据

1、PD1及CTLA4蛋白表达检测

 
 

图1BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠蛋白表达检测。

在未刺激情况下，hPD1/hCTLA4纯合小鼠脾脏中能够检测到hPD1的蛋白表达；anti-CD3e抗体刺激后，在野生型小鼠脾脏中检测到mCTLA4蛋白表达，在BALB/c-hPD1/hCTLA4纯合小鼠脾脏中检测到hCTLA4的蛋白表达。

2、T/B/NK细胞比例检测

 
 

图2BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠T/B/NK细胞比例检测。

野生型小鼠与BALB/c-hPD1/hCTLA4纯合子小鼠外周血及脾脏中的T/B/NK细胞比例接近。

3、体内药效验证

图3基于BALB/c-hPD1/hCTLA4的抗体体内药效试验。

将对数生长期的结肠癌细胞CT26接种至6-8周龄的BALB/c-hPD1/hCTLA4皮下，待肿瘤生长至平均体积约100mm³时随机分为PBS（对照组，n=7），Ipilimumab0.2mg/kg组（n=7），Keytruda10mg/kg组（n=6），Ipilimumab0.2mg/kg +Keytruda 10mg/kg组（联合用药组，n=7）,使用相应药物进行治疗，每3天给药1次，共给药7次。

结果显示：Ipilimumab0.2mg/kg组可部分抑制肿瘤生长（D19:TGI=64%），Keytruda10mg/kg组也可部分抑制肿瘤生长（D19:TGI=58%），而Ipilimumab0.2mg/kg +Keytruda 10mg/kg联合用药对肿瘤生长抑制效果明显（D19:TGI=96%）。数据以Mean±SEM形式呈现。

结果证明：BALB/c-hPD1/hCTLA4双人源化小鼠是评估anti-hCTLA4和anti-hPD1抗体体内联合药效的理想动物模型。

四、小鼠的基础信息

编号	T003720
品系名称	BALB/cJGpt-Pdcd1em1Cin(hPDCD1)Ctla4em1Cin(hCTLA4)/Gpt
简称	BALB/c-hPD1-hCTLA4
品系类型	Knock-in
相关基因	hPDCD1; hCTLA4
背景鼠及背景鼠编号	[N000020] BALB/cJGpt
毛色	白色
应用领域	CTLA4 抑制剂药效评价或人PD1抑制剂。 人CTLA4抑制剂及人PD1抑制剂联合用药药效。 人CTLA4抑制剂及人PD1抑制剂毒理学评价。 抗肿瘤研究。 自身免疫病研究。

五、饲喂条件

温度	21-26 ℃
湿度	40-70%
光照	8:00 am - 20:00 pm光照，20:00 pm – 8:00 am（次日）黑暗
笼具尺寸 （长宽高）	艾可林（300mm×190mm×135mm）
垫料	玉米芯
饲料	自由取食。采用标准SPF级辐照实验鼠转基因饲料，购于江苏协同医药生物有限责任公司。每批饲料由生产单位提供饲料质量合格证，每年提供第三方的检测报告；检测标准参照国家标准GB 14924.3-2010 《实验动物配合饲料营养成分》和GB14924.2-2001《实验动物配合饲料通用卫生标准》
饮水	自由饮水。饮用水外观和细菌指标每月检测一次，在本公司内检测，每年提供本区自来水公司检测报告，参照国家标准GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》
动物标记	耳号
换笼频率	两周/次
动物适应饲养时间	3天及以上

 

六、小鼠遗传质量控制标准

品系编号	T003720
品系名称	BALB/c-hPD1-hCTLA4
品系背景	BALB/c
检测方法	高通量KASP基因分型技术
检测原则	20条染色体，每条染色体近似等距离挑选3-5个位点
检测结果	阳性纯合子
检测频率	1年/次

七、相关产品与服务

相关产品	BALB/c-hCTLA4; B6-hCTLA4; BALB/c-hPD1/hCTLA4; B6-hPD1/hCTLA4; BALB/c-hPD1/hPDL1/hCTLA4;
相关服务	药效服务评价 成瘤性测试 筛选以CTLA4为基础的双特异性抗体 毒性评价 荷瘤鼠
服务优势	支持IND申报 自主产权品系 完善的服务体系 AAALAC认证的动物设施

八、F&Q

1、小鼠的体重和生长曲线

2、荷瘤相关

2.1 GVHD评分标准

2.2影响CDX荷瘤效果的因素

• 细胞株自身的成瘤性；不同细胞株的成瘤快慢会有差异，建议客户正式实验之前摸索细胞株成瘤性或参考已发文献；

• 细胞接种时的状态及活率：建议取处于对数期生长的细胞进行接种，避免体外过度传代影响细胞状态。接种前对细胞活率进行检测，一般建议95%以上；

• 支原体污染：建议接种前对细胞进行支原体检测，如果存在支原体感染，细胞增殖缓慢，形态异常；

• 接种的剂量：不同的细胞系、不同的小鼠周龄和接种位置所需要的细胞剂量会有差异，建议正式实验之前摸索出最佳细胞注射剂量；且不同批次实验，细胞计数方式（人工或者仪器等）保持一致；

• 接种方式：常用的接种部位有皮下、尾静脉和原位。建议根据细胞株成瘤性和实验目的选择合适的接种部位；

• 选择的免疫缺陷小鼠：不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周龄的成瘤速度有所差异，建议客户根据预实验结果选择合适的动物模型，参考已发文献。

• 其他辅助因子；根据细胞株类型选择实验中是否需要添加matrigel和hormone；

• 小鼠在运输过程中会产生应激反应，使小鼠出现一系列的病理生理学变化，这些变化会增加某些实验误差，因此客户在接到动物后应尽量避免立即进行实验，建议让动物有5-7天的适应期。

由于影响成瘤的因素较多，且个体差异肿瘤生长的速度不完全同步，实验中建议适当增加小鼠的富余量，一般15%~20%。另外，不同的瘤种生长周期不同，从数天到几周不等，建议注意观察周期。

2.3荷瘤后小鼠出现大面积死亡原因

• 环境因素：动物房是否为SPF级，同期是否有饲养其他免疫缺陷鼠。

• 细胞或试剂污染：细胞或所用试剂是否有支原体或其他细菌病毒感染。

• 接种方式：如尾静脉接种可能会出现由于引物空气带来的心脏栓塞导致的小鼠死亡。

• 肿瘤细胞的恶性程度：荷瘤后恶性细胞的快速增殖或浸润也可能会导致小鼠死亡。

3、小鼠的饲养繁育

3.1 小鼠常见的健康问题

脱毛：小鼠在理毛过程中经常脱毛，通常无害。但打斗、皮肤疾病等引起的脱毛应予以重视，并给予及时、有效的护理。

打斗：雄鼠性成熟后合笼有时会发生打斗现象。打斗导致的伤口通常发生在尾根、背部、阴茎、肛门，或足部、肩部。打斗导致的伤口常常伴随流血和结痂。在笼具中放置玩具等可吸引小鼠的注意力，避免打斗现象。打斗现象严重时，应对受伤小鼠给予相应的抗生素治疗，并将攻击性强的小鼠（通常没有伤口）移出。某些品系的小鼠，如FVB、BALB/c、SJL攻击性较强。

牙齿咬合不正：当小鼠体重增长明显慢于其它同窝出生的小鼠时，应检查该小鼠的门牙是否咬合不正，包括上下门牙是否咬合、下门牙是否过长、上门牙是否弯曲向内生长。对此类小鼠，可用消毒后的剪刀对其门牙定期进行修剪。除为动物模型可能的表型外，偶发性的牙齿咬合不正的小鼠应及时对其实施an乐死。

肿瘤/肿块：肿瘤或肿块可在小鼠身体的任何部分发生。应定期观察小鼠的体态是否平滑、对称。在集萃药康，以下情况将影响小鼠的饮食、行动等行为，并影响小鼠的身体状况，建议应及时对小鼠实施an乐死：自发性或外源接种的肿瘤/肿块生长超过动物原体重的10%、平均肿瘤直径超过20mm或肿瘤体积≥3000mm³、肿瘤影响动物行走或进食、肿瘤转移、肿瘤快速增长至溃烂（肿瘤破溃直径≥10mm）或肿瘤造成感染或坏死等。

皮肤溃烂：小鼠皮肤溃烂可能由多种因素引起，包括打斗、抓挠耳标、寄生虫等。当小鼠的皮肤溃烂持续难愈，或皮肤溃烂超过体表面积的10-20%时，应及时对其实施an乐死。

直肠（肛门）脱落：在一些品系的小鼠中常见直肠（肛门）脱落，其原因不明。通常对此类小鼠应定期观察，发现直肠/肛门脱落时需用湿润的纱布将将脱落的部分推入体内。当直肠（肛门）脱落部分过大、出现坏死或小鼠健康状况明显下降时，应及时对其实施an乐死。

子宫脱落：小鼠生产后，有时会出现子宫脱落现象。应注意区分子宫脱落与直肠（肛门）脱落。子宫脱落通常导致小鼠的极度不适，应及时对其实施an乐死。

小鼠行为：每次打开笼具时，应观察小鼠的行为，特别应注意比较同笼饲养的小鼠之间行为。包括小鼠是否活跃，是否表现出迟钝或昏睡；或表现出明显的不适；小鼠是否表现出弓背或呼吸困难；是否表现出过度的抓挠等现象。出现上述现象，应对小鼠做进一步细致的观察和检查。

贫血：应定期检查小鼠是否患贫血。检查小鼠足底的颜色是检查小鼠是否贫血快速、有效的方法。如小鼠足底呈现苍白或无血色，应进一步检查小鼠是否患有贫血症，并相应补充营养。

脱水：脱水的小鼠通常表现出以下特征：眼睛凹陷，面部毛发杂乱，触碰后皮肤不能很快恢复正常状态。皮下注射电解质后，一部分脱水小鼠可能会恢复，但大部分情况下，小鼠的状态会进一步恶化，最终导致死亡。因此建议应及时对其实施an乐死。如脱水小鼠的体温过低（触碰有冷的感觉），这些小鼠的健康状况尤其恶劣，应及时对其实施an乐死。

腹泻：腹泻小鼠通常伴随流质样的粪便，其粪便通常较为湿润。判断小鼠是否腹泻的简单、易行的方法是观察笼具：垫料是否与粪便粘附在一起，或粘附于笼具壁上。同时应观察小鼠肛门附近毛发是否被粪便染色，或粘着粪便。小鼠腹泻的可能原因多样，如环境温度、饮食饮水、病原感染等，应根据实际情况进行原因排查并给予相关治疗。腹泻的小鼠应注意观察是否存在脱水现象和/或体重的明显变化。

体温过低：当小鼠体温过低（低于36.5C或触碰有冷的感觉）时，应引起重视。严重情况下，小鼠会表现出行动迟缓甚至丧失知觉。如不能对其提供保温和兽医护理，应及时对其实施an乐死。

黄疸：小鼠出现黄疸（或皮肤发黄）通常是由于肝脏和/或胆囊功能的异常，或红细胞的不正常破坏引起的。耳朵因毛发覆盖较少，是观察小鼠黄疸较理想的位点。

尿道/阴道分泌物：病原体感染、泌尿系统/生殖系统肿瘤、流产等原因可能会导致白色或带血不正常尿道/阴道分泌物，应请兽医关注，并予以相关治疗。

呼吸异常：如小鼠存在呼吸困难、呼吸急促或啰音，通常提示小鼠存在较大健康问题，需进行进一步诊断判断可能的原因，必要时应及时对其实施an乐死。

行动异常：小鼠的运动性共济失调、转圈或无力通常是严重疾病的前兆或表征。应密切观察小鼠饮食、饮水及体重的变化。

眼部疾病：需鉴别眼部疾病的种类，如白内障、角膜溃疡、结膜炎等。角膜的发炎、溃烂，经治疗后无明显好转，应及时对其实施an乐死。此外小鼠瞳孔的异常放大或缩小、眼球的外凸或内陷可能是一些疾病的表现，需要结合小鼠的既往史进行诊断。

头部偏斜：小鼠的头部偏斜（头部持续偏向一侧）由多种可能的因素引起（如中耳炎、前庭综合征等），应密切关注小鼠健康状况。头部偏斜严重时，小鼠将不能站立、行走、饮食、饮水。在此情况下，应及时对其实施an乐死。

异常活跃：小鼠行为的异常活跃由多种可能的因素引起，应密切观察。小鼠行为的异常活跃有时可能暗示神经系统的异常。

行动迟缓：如小鼠表现出行动迟缓、昏迷、弓背等症状，通常提示小鼠存在健康问题，应及时对其实施相应护理或实施an乐死。

麻痹/瘫痪：如小鼠表现出虚弱、无力支撑其体重，但仍可移动其四肢，应密切关注小鼠健康状况。小鼠的麻痹可能最终导致其瘫痪。多种因素可能导致小鼠失去运动能力而瘫痪。一部分小鼠可能可以从瘫痪中恢复（如脑脊髓炎模型等），在此情况下，应对小鼠提供特别护理，如保温、更易获得食物、饮水等。小鼠通常不能由病理因素（如癌细胞侵入脊髓）引起的瘫痪中恢复，应及时对其实施an乐死。瘫痪小鼠如存在极度丧失体重、褥疮或自残行为，应及时对其实施an乐死。

毛发散乱：如小鼠毛发散乱，通常是疾病的前兆或表征。应密切观察小鼠饮食、饮水及体重的变化。

颤抖：频繁、严重的颤抖通常是疾病的前兆。应密切观察小鼠饮食、饮水及体重的变化。

3.2 小鼠脱毛的原因及检测

健康的小鼠会定期理毛，被毛整洁、平滑而有光泽。一般小鼠常因打架，生理性理毛（C57BL/6常见，雌性居多），消毒剂刺激，遗传因素，营养因素（缺乏必须的氨基酸，维生素），营养因素，饲养密度过大，微生物感染（寄生虫，真菌，细菌）等导致其脱毛。当一笼内只有一只小鼠毛发整齐，其它小鼠有脱毛的，建议将未被理毛的小鼠提出单独饲养。如果整笼小鼠均脱毛严重，建议添加福利玩具给小鼠。如若怀疑是寄生虫感染造成的脱毛建议用透明胶带粘一下脱毛部位与健康部位交界处，显微镜检确定是否有体外寄生虫感染。如若怀疑是细菌或真菌感染，可分别取皮肤拭子培养或PCR检测以确定是否感染病原微生物。

• 打架

笼养小鼠的习惯特点和群体内部反应常导致其殴斗、咬尾和嚼须，同性别同笼饲养的雄性小鼠更易发生殴斗，雄性小鼠常以殴斗的形式来称霸于同笼其它雄性小鼠以巩固自己的统治地位。

• 生活习性——理毛

通常此类的脱毛见不到皮肤的损伤，也没有明显的红肿等炎症现象。国外也曾有报道，小鼠建立群体统治等级制度是通过咬毛和嚼须的形式来实现的。

• 机械性损伤

小鼠的口鼻脱毛除咬毛嚼须外，还有可能是机械性损伤引起的。小鼠有很强的好奇心，在笼养过程中有些小鼠会将口鼻插入笼盒的通风口，长时间的摩擦可引起机械性损伤。

• 消毒液刺激

实验室在日常的管理中有些会用到季铵盐类的消毒液，应考虑是否在实验过程中错误的使用了季铵类消毒液而产生的直接影响。如在实验中镊子浸入季铵类消毒液中未经冲洗便用其将小鼠从一个笼具转移到另一个笼。该类皮肤病灶可使肩胛部和颈部被毛出现黄斑、脱毛，患部硬结，进而导致皮肤粗糙。

• 其它因素

遗传因素、营养因素（必须氨基酸缺少、维生素缺乏）、饲养密度过大等都可能会引起小鼠的脱毛现象。

3.3小鼠一整笼异常死亡的可能原因

建议客户排查笼盒的通气情况，如果笼盒没放好小鼠容易被闷死，并且单个笼盒的通气与否和其他笼盒的通气情况没有直接关系。

3.4 小鼠出现水肿原因

一般情况下，出现水肿可能因为心脏或者代谢方面的问题，这种情况多为散发或个例，发现后建议对小鼠实施an乐死。

4、供鼠相关

4.1常规销售品系发货标准及注意事项

7W以下（含）的小鼠订单参照生产部门发布的《药康常规销售品系发货标准》。

大于7W的小鼠个体间体重差异相对偏大，且大周龄鼠数量较少，所以发鼠时只满足数量要求，对体重不做严格质控。如果客户对体重范围有具体要求，务必下单前与生产充分沟通，确认可以满足客户要求后再下单。

《接鼠须知》会随鼠一起发给客户，请提醒客户接收到小鼠后，第一时间阅读《接鼠须知》并核对接收小鼠是否与订购信息一致，如有任何异常情况，请认真拍照并于接鼠后24h内反馈给我们，最迟不超过48h，超过48h由于小鼠在客户设施内饲养一段时间，出现的异常不代表我们运输小鼠的真实情况，我们会为客户提供技术支持，但不再承担相应责任。

4.2关于老龄鼠下单注意事项

目前我们设施发出的老龄鼠均为淘汰繁殖笼，可能会出现脱毛、肥胖现象，雄鼠外观睾丸小或观察不到的情况。另外，淘汰雄鼠因曾与次数交配过，具有领地意识，在包装淘汰雄鼠时，建议一只一盒包装，如若混包，极有可能出现打架受伤死亡的情况，客户接收到之后应立即分笼饲养，不可再继续混放在同一笼盒中。下单前务必和客户充分沟通以上风险。

4.3运输途中小鼠发生打架现象

运输过程中小鼠会出现不同程度的打架现象，尤其是雄性及母性不好的品系。6W以上或接近性成熟的小鼠领地意识增强，且对气味敏感，会导致动物之间的相互打斗。在条件许可的情况下，建议尽可能降低动物的包装密度，根据笼盒情况分批进行包装，避免非同笼小鼠一起包装时。请在下单前告知客户风险。

4.4 运输应激对体重影响

运输过程中带来的应激反应会加速动物的代谢和排泄。在得不到饮食补充的情况下，动物会出现不同程度的脱水状况。一般运输所造成的小鼠体重消耗为10%左右，多的会到15~20%。建议客户收到以后，按照鼠盒密度标准摆放，尽量饲养在避光、噪音小的地方，适当在笼盒中加碎饲料、果冻等辅助饮食，避免缺水导致的应激情况加重，普通品系一般适应性饲养一周左右可以恢复。

由于运输及后续饲养环境差异，我们在发鼠时仅保证小鼠出库时体重与订单要求/质控标准一致，客户收到鼠后可能会有稍许浮动，需要提前和客户充分沟通此情况。

4.5 适应性饲养

运输应激会对不同遗传背景实验小鼠的代谢、神经内分泌和免疫功能等方面产生不利影响。而这些影响会增加某些实验误差，因此客户接到动物后应尽量避免立即进行实验，而是应该根据运输时间的长短让动物有5~7天的适应期。

4.6客户收到鼠后反馈微生物异常判断原则

客户收到小鼠后，如果发现微生物异常，需第一时间反馈：

1）发现有飞虫等可眼观虫体，需于开箱后的当天进行反馈，并详细记录动物到达时间，动物的传递及开箱过程，同时提供该过程的照片及视频材料，确认飞虫来自于包装盒内或周围环境。如接鼠设施中存在感染风险点，虫体有可能会附着在包装盒外侧，包装盒打开后很容易被感染，建议客户收到小鼠后，先检查盒子外观是否密封正常，在盒子外面喷洒消毒液3-5分钟后再拆箱。

2）发现SPF级动物国家标准检测项为阳性，需于检测完成的当天进行反馈，并提供检测报告（含检测单位、检测项、检测方法及检测结果）。对于客户接收到小鼠后直接原包装送第三方检测的结果相对可靠，如果客户收到小鼠后，拆箱操作二次包装后再送检第三方，这个过程存在感染风险，所以检测结果无法代表运输小鼠的实际微生物情况，我司不承担相应责任。

参考文献

1. Flemming, A. "Cancer: Pd1 Makes Waves in Anticancer Immunotherapy." Nat Rev Drug Discov 11 8 (2012): 601.

2. Migden, M. R., et al. "Pd-1 Blockade with Cemiplimab in Advanced Cutaneous Squamous-Cell Carcinoma." N Engl J Med 379 4 (2018): 341-51.

3. Zhou, Q., et al. "Coexpression of Tim-3 and Pd-1 Identifies a Cd8+ T-Cell Exhaustion Phenotype in Mice with Disseminated Acute Myelogenous Leukemia." Blood 117 17 (2011): 4501-10.

4. Peggs, Karl S., et al. "Blockade of CTLA-4 on both effector and regulatory T cell compartments contributes to the antitumor activity of anti–CTLA-4 antibodies." Journal of Experimental Medicine 206.8 (2009): 1717-1725.

5. Blank, Christian U., and Alexander Enk. "Therapeutic use of anti-CTLA-4 antibodies." International immunology 27.1 (2014): 3-10.