一、试剂配制

1. LB液体培养基。

2. 100 mg/ml氨苄西林储存液：称取25g的氨苄西林粉末，加去离子水至250ml，完全

溶解后过滤、分装，20℃保存。

3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-盐酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-盐酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去离子水至500ml，高压灭菌，贮存于4℃。

4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氢氧化钠溶液，1％ SDS（10 N 氢氧化钠20 μl，10％SDS 100μl，加去离子水至1ml），使用前临时配制。

5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸钾300ml，冰醋酸57.5ml，加去离子水至500ml，4℃保存。

6. 苯酚：氯仿（1：1，V／V）（酚和氯仿均有很强的腐蚀性操作时应戴手套！）。

7. 无水乙醇。

8. 70％乙醇。

9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超纯水溶解，然后在沸水煮

15min，分装，20℃保存。

10. TE缓冲液：10 mmol/L Tris-盐酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。

二、实验方法

1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液体培养

基中。37℃、250 r/min振荡培养过夜（约12——14h）。

2. 取1.5ml细菌培养液倒入离心管中，4℃、6000转离心30s，弃上清，将离心管倒置于纸巾上，去除残留液体。

3. 菌体沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，室温下放置5 min。

4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5——10次，以混匀内容

物，冰浴5min。

5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒5——10次混匀，冰浴3——5min，4℃、6000转离心5min。转移上清到一个新的1.5ml Ep管中。

6. 加入等体积的酚一氯仿抽提剂，振荡混匀，4℃、6000转，离心2 rain。

7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍体积用冰预冷的无水乙醇于室温沉淀双链

DNA，混匀，室温放置2--5rain，4℃、6000转离心5min。

8. 弃上清，将离心管倒置于纸巾上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇，盖紧离心管颠倒数次，4℃、6000转，离心2min。

9. 去除所有的乙醇溶液，将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥5——10min，直到乙醇都挥发干净。

10.将质粒DNA沉淀溶于50 μl TE缓冲液（含20 μg/ml RNaseA）中，温和振荡数秒，-20℃储存备用。

2. 加入SDS后则要注意不能过分用力振荡，温和混匀，但又必须让它反应充分。

3. 加入溶液Ⅱ混匀之后，一定要在冰上放置，不要摇动，对于溶液Ⅲ同样处理。