实验方法

蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

难度系数: 2.0

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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由weber和Osborn进一步完善。主要用于（1）蛋白质的分离（2）蛋白质的纯化。

SDS-PSGE

实验原理

蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4 g SDS/1 g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
 
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。

实验材料

蛋白质样品

试剂/试剂盒

丙烯酰胺 甲叉-双丙烯酰胺 蒸馏水 SDS  过硫酸胺 TEMED Tris 甘氨酸 Tris-HCl DTT 溴酚兰 甘油 正丁醇

仪器/耗材

移液器 移液管 烧杯 垂直电泳槽 电泳仪

实验步骤

一、试剂
 
1.  30%凝胶贮备液：称取29 g 丙烯酰胺（Acr）和1 g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100 ml，滤纸过滤贮存。
 
2.  10% SDS：称取SDS 10 g 加蒸馏水至100 ml。
 
3.  10%过硫酸胺（AP）
 
4.  N，N，N'，N'四甲基乙二胺（TEMED）
 
5.  5x电泳缓冲液：于900 ml蒸馏水中分别加入15.1 g Tris、94 g甘氨酸、5 g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000 ml。
 
6.  1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)
 
7.  电泳加样缓冲液
10 mmol/LpH6.8 Tris
200 mmol/LDTT
4%SDS
0.2% 溴酚兰
20% 甘油
 
8.  正丁醇
 
二、器材
 
移液器、移液管、烧杯、垂直电泳槽、电泳仪。
 
三、操作步骤
 
1.  配制分离胶浓度8%、体积15 ml
H2O ：6.9 ml
30%凝胶贮备液 ：4.0 ml
1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) ：3.8 ml
10%SDS： 0.15 ml
10%过硫酸胺： 0.15 ml
TEMED： 0.01 ml
 
2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
 
3.  聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。
 
4.  配制5%成层胶5 ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。
H2O ：3.4 ml
30%凝胶贮备液： 0.83 ml
1.0 mol/Ltris-HCl(pH6.8) ：0.63 ml
10%SDS ：0.05 ml
10%过硫酸胺： 0.05 ml
TEMED ：0.01 ml
 
5.  在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3 min。
 
6.  成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。
 
7.  加样。
 
8.  电泳：开始时电压为8 V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。
 
9.取下凝胶，固定、染色或进行分析。

注意事项

1. 跑SDS-聚丙烯酰胺电泳时恒压不如恒流好控制，电压过高产热过多，电压过低跑得太慢，效果上来说恒流恒压都差不多。


2. 在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCl缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl–却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。


3.  聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4°C冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。


4. 用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且sDs—PAGE 测定分子量有10%误差，不可完全信任。


5. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（Q一胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS一聚内烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的相对分子量。


其他

1. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用：


（1） 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；


（2）制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择Tris-HCl系统；（3）TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；


（4）十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。


2.  根据样品分离目的不同，SDS-PAGE样品有三种处理方法：


（1） 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样；


（2）。 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，室温保温30min；


（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

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