超声波破碎法
实验原理
实验步骤
1. 挑取培养皿上单一菌落,培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中,以120 rpm 转速震荡,在37℃下培养过夜。
2. 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中,以120 rpm 37℃培养至A600 = 0.6 后,加入IPTG成为1 mM浓度,继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。
3. 将菌液倒入50 mL 离心管 (conical tube) 中离心10 min (5 000 rpm)。
4. 倒去上清,可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。
5. 取出含菌块的离心管置碎冰上,待菌块溶解后,以残存液体均匀悬浊的。再加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。
6. 将菌液放在液态氮中冷冻1 min,然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次,尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。
7. 离心20 min (12 000 rpm,4℃) 取上清共 _____ mL,称为 粗抽取液 (XT);预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上,以低温进行实验。
8. 此上清加入5 mL buffer A-0 混匀后倒入烧杯,置碎冰上放冷,不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm,使成为70%饱和度,加完后再搅拌10 min。
9. 离心20 min (12 000 rpm,4℃) 后小心倒去上清,取白色沉淀部份。
10. 沉淀加以2 mL buffer A-150 均匀悬浊的,再以桌上型离心机去除不溶物质,(10 000 rpm,5 min),共得 ______ mL,称为 全蛋白质 (TP);预留100 uL,连同上述XT 置4℃冷藏。
11. 其余溶液部份准备进行胶体过滤层析,标示清楚后置4℃冷藏。
注意事项
1. 操作时总是小体积小量的操作,避免污染,并且动作要快。
2. 蛋白酶普遍存在,在提取蛋白质的步骤中,早些抑制,经常抑制。
3. 分装蛋白溶液,储存于不同的温度和不同的缓冲液中,测蛋白活性,找出最适储存条件。
4. 冷藏,并加入稳定剂。这些稳定剂一般都能充分保持蛋白的生物学活性。
5. 避免酶的反复冻融,如果酶需要冻存,分装成小管后冻存。
其他
1、仪器用具
恒温震荡培养箱37℃;高速冷冻离心机及离心管 (使用20,000 rpm离心陀)使用高速离心机要注意: 离心机及离心陀的温度要预冷完全,相对位置的两只离心管要平衡好,离心陀转速绝对不能超过最高速限;液态氮及冰筒;37℃温水浴。
恒温震荡培养箱37℃;高速冷冻离心机及离心管 (使用20,000 rpm离心陀)使用高速离心机要注意: 离心机及离心陀的温度要预冷完全,相对位置的两只离心管要平衡好,离心陀转速绝对不能超过最高速限;液态氮及冰筒;37℃温水浴。
2、药品试剂
转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落;LB/amp/kan 及IPTG (1 M stock);Lysis buffer (50 mM Na3PO4·12H2O, pH7.0; 0.1 M NaCl;0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100)使用前添加成10 mM
转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落;LB/amp/kan 及IPTG (1 M stock);Lysis buffer (50 mM Na3PO4·12H2O, pH7.0; 0.1 M NaCl;0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100)使用前添加成10 mM
β-mercaptoethanol,25 ug/mL PMSF,40 ug/mL lysozyme.Buffer A-0 (50 mM Na3PO4, pH7.0) 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM 最终浓度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl;硫酸铵(要烘干并以研砵磨碎)。
3、蛋白质的储存:
(1)蛋白样品在液氮中速冻,拿出后加入10-20%的甘油,长期储存。
(2)整个实验过程中,都要将蛋白样品置于冰上。
(3)从母管中吸取不同的蛋白时,都要用新鲜的枪头。
(4)不要将未用的溶液倒回母管。
(5)戴手套操作,避免蛋白交叉污染,或是蛋白酶的污染。
(6)避免剧烈的震荡,避免溶液中混入蛋白变性剂。
(7)实验的过程中应避免灰尘进入,灰尘包含60%的肌氨酸。