1885 年，一位妇人带着她被恶犬咬伤的孩子来到路易斯・巴斯德实验室的门口，苦苦哀求巴斯德救救她的孩子。巴斯德也因此给这个孩子注射了人类历史上的第一针狂犬病疫苗。此后的一百多年中，狂犬病疫苗取得了巨大的成功，也因此挽救了无数人的生命。
但不幸的是，除了疫苗之外，一百年后的人类并没有其他手段来应对这种发病后死亡率接近 100% 的可怕疾病。 图片来源：Genome Biology

2020 年 9 月 1 月，来自华中农业大学的赵凌教授带领团队在 Genome Biology 发表了 A novel antiviral lncRNA, EDAL, shields a T309 O-GlcNAcylation site to promote EZH2 lysosomal degradation 的论文 ^[1]，报道了神经系统中一种名为 EDAL 的长非编码 RNA (lncRNA) 在包括狂犬病病毒在内的嗜神经病毒中的抑制作用，为狂犬病病发后的治疗带来了新的曙光。

研究内容 作为人类最重要的系统之一，我们的中枢神经系统（CNS）在病毒感染面前格外脆弱。包括新冠在内的新发病毒有一半以上能够感染神经系统，而且难以根除。但令人惊讶的是，这个脆弱的神经系统却拥有着种类繁多的 lncRNA 表达，人体中有超过 40% 的已知 lncRNA 是大脑特异性的。
图片来源：Genome Biology 为了探究大脑中 lncRNA 多样性与病毒易感性之间的关系，作者对感染了狂犬病病毒的神经细胞和对照组细胞进行了 RNA-seq，并筛选出 1434 个出现显著变化的 lncRNA。
通过对其中的 6 个进行克隆过表达，作者发现 XLOC_007537 在多种嗜神经病毒感染后都出现了显著上调，这种上调也仅仅在神经细胞系中出现。这证明 XLOC_007537 是一种病毒诱导的神经特异性 lncRNA。更重要的是，过表达 XLOC_007537 能够有效阻止狂犬病病毒感染神经细胞。由于后续实验表明 XLOC_007537 能够结合 EZH2 并导致后者的降解，所以作者将其命名为 EDAL (EZH2 degradation-associated lncRNA, EDAL)。 图片来源：Genome Biology 为了进一步验证 EDAL 的功能，作者在 N2a 神经细胞中敲入与敲低了 EDAL，并发现敲入与敲低 EDAL 分别降低与增加了狂犬病病毒滴度。在其他诸如水疱性口炎病毒（VSV）、单纯疱疹病毒 (HSV-1) 与生里基森林病毒（SFV）的嗜神经病毒中，作者也观测到了类似的现象。这些数据证明 EDAL 能有效阻止多种嗜神经病毒的复制。
图片来源：Genome Biology 随后，作者对 EDAL 在狂犬病病毒中的作用进行了动物实验验证。感染携带 EDAL 基因的狂犬病病毒后，小鼠的存活率显著高于对照组小鼠，并在体重、临床评分、以及病毒拷贝等多项指标上出现了明显的改善。免疫组化染色也证明多个脑区中的狂犬病病毒 P 蛋白与 CD45⁺ 细胞数都出现了明显的降低。这些数据进一步佐证了 EDAL 对狂犬病病毒的抑制作用。 图片来源：Genome Biology 由于作者发现过表达 EDAL 的神经细胞中出现了组蛋白表观修饰标记 H3K27me3 的明显下调，作者进一步假设 EDAL 的抗病毒作用与表观遗传学调节有关。之后，作者顺藤摸瓜，找到了具有组蛋白甲基转移酶活性的 EZH2 (enhancer of zeste homolog 2) 在过表达 EDAL 后也出现了下调。通过敲低和敲入 EDAL，作者证明 EDAL 可以通过控制 EDAL 的含量以控制 H3K27me3 标记的发生。 由于 EDAL 不能改变 EZH2 在 mRNA 层面的表达，作者假设 EDAL 可能会直接导致 EZH2 的降解。为了验证这一猜想，作者使用 MG132 和氯化铵分别抑制了具有蛋白降解活性的蛋白酶体与溶酶体，并发现在溶酶体的功能被抑制后，EDAL 的过表达不再能促进 EZH2 的降解。免疫荧光染色则进一步证明了 EZH2 与溶酶体在位置上的重合。因此，这些数据表明 EDAL 是通过溶酶体促进 EZH2 降解来调节组蛋白的表观遗传学修饰。

图片来源：Genome Biology 为了进一步研究 EDAL 上的哪一段序列是其抗病毒作用的关键，作者在分析 EDAL 的结构后将其分为了 4 个区域，并分别验证了它们对 EZH2 的降解作用。结果显示，只有 EDAL-1 能有效降低 EZH2 和 H3K27me3 的含量以及狂犬病病毒的复制。通过将 EDAL-1 中不同序列敲除，作者发现 EDAL-1 上位于 98-153 之间一段长度为 56 碱基的序列可能是其抗病毒作用的关键。将这段序列转入其他 lncRNA 结构中后，作者也观测到了一样的抗病毒作用。 由于此前有研究报道 EZH2 的磷酸化和 O - 乙酰氨基葡萄糖 (O-GlcNAc) 修饰都能影响其稳定性。作者通过 EZH2 上磷酸化和 O-GlcNAc 修饰位点的突变将其一一排除，最后确定 EDAL 可以通过阻断 EZH2 的 T309 上的 O-GlcNAc 修饰来促使其降解。

图片来源：Genome Biology 最后，作者使用 RNA-seq 和 ChIP-seq 探究了 EDAL 导致的表观遗传学变化到底影响了什么蛋白的表达，并因此抑制了狂犬病病毒的复制。名为 PCP4L1 的蛋白在两种高通量测序中脱颖而出。过表达 PCP4L1 能够显著抑制狂犬病病毒的复制。且敲低该蛋白后，敲入 EDAL 不再能抑制狂犬病病毒复制。这些数据证明 EDAL 是通过上调 PCP4L1 来抑制狂犬病病毒的复制。
研究意义：

图片来源：Genome Biology 该研究通过精细的实验设计与大量的工作证明了 EDAL 作为一种 lncRNA, 能够通过其特定序列阻断 EZH2 的糖基化，并以此促进其降解。由于 EZH2 的降解导致的 H3K27me3 变化则会导致 PCP4L1 的上调，并最终达到抑制包括狂犬病病毒在内的多种嗜神经病毒的效果。与此同时，研究团队还确认了该机制中起关键作用的序列以及修饰位点，这对相应药物的设计也非常有帮助。 除此之外，作为一个长度为 68 个氨基酸的肽段，PCP4L1 是如何抑制嗜神经病毒的增殖？我们又能否从中获得一些可成药的抗病毒靶点？都值得更多的研究来解答。
延伸阅读： 本文的通讯作者，本硕都就读于华中农业大学的赵凌教授自 2004 年赴美攻读博士学位起就开始研究狂犬病病毒。一研究，就在这个相对小众的领域耕耘了 16 年。2012 年回到母校后，赵凌教授带领团队在狂犬病领域先后发表多篇重要论文。

图片来源：Journal of Virology 2017 年，赵凌教授就先后在病毒学顶级期刊 Journal of Virology 发表了题为 A Novel Rabies Vaccine Expressing CXCL13 Enhances Humoral Immunity by Recruiting both T Follicular Helper and Germinal Center B Cells^[2] 与 Overexpression of IL-7 extends the humoral immune response induced by rabies vaccination^[3] 的研究，提示我们如何进一步改善狂犬病疫苗的保护效果。 这次发现狂犬病病毒的重要「开关」，是赵凌教授十六年来不忘初心最好的回报。也希望相关药物尽快投入到临床使用之中，造福更多受到狂犬病病毒威胁的人们。