基本原理

CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫，用于降解入侵的外源 DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂，如下图所示。

通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA (single guide RNA)。通过将表达 sgRNA 的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行基因操作，在 PAM (5'-NGG) 上游～3bp 进行切割，如下图所示。

因此本实验的关键步骤是设计一对 20bp（不包括 NGG 在内的）完全互补的 oligo 插入到如上图所示的 filler。另 U6 启动子需要 5' 端的 G 起始转录，因此若设计的 oligo 第一个碱基非 G，需额外增加一个 G。

操作详细流程

1. 设计 sgRNA

关于 sgRNA 的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握 gRNA 的设计，常用方法汇总解析》

确定靶基因的序列，可通过在线网站设计 (http://tools.genome-engineering.org )，或根据靶基因的 CDS 序列自行设计，最方便的是在 human KO Library sgRNA 里选择。无论选择哪种方式，都建议进行一下 blast。

附上在线设计网页截图。输入基因的 name，填写 email address，设计结果稍后会发送到此邮箱，选择序列的类型以及物种。如 sequence type 选择 unique region，一次只能输入 23～500bp 的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免 guide 序列跨越内含子，都选择键入后点击提交，关注邮箱或者在线等。

分析中，显示你所键入的基因序列里有 36 对可选的 guide 序列。

分析结束，点击 Download as genbank 查看结果，此时也会收到邮件。

选择分数较高的 Guide 序列，以 Guide#1 序列为例，2 条单链 oligo 的序列如下：oligo1：5'- caccG CGTTCAAGTACCAGTTCGTG - 3'; oligo2：5'- aaac CACGAACTGGTACTTGAACGc。标红部分与经 BsmBI 酶切后的载体互补配对。BsmBI 又名 BbsI。

oligoDNA 序列的第一个碱基必须是 G，如选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G，需自行添加一个额外的 G。

2. Oligo 退火形成 duplex

PCR 仪 95℃ 5 min，缓慢降温至室温 1 h，1：200 稀释 duplex。

3. 质粒酶切

4. 胶回收

大片段约 11kb 回收；小片段约 2kb 为切下来的 filler，不要。

5. 连接

室温连接 4 - 6 h。

6. 转化（Amp+），挑克隆，摇菌，抽提质粒，测序！

7. 转染

24 孔板，细胞不要过满，同实验室日常转染操作，可选择性设置三个平行。同时转染空载作为阴性对照。每孔 500 ng。

8. puromycin 筛选

转染稳定 48 - 72 h 后加 puromycin 进行筛选，1～3g/mL，直至不再有细胞数量稳定，不再有细胞因不耐药死去。

9. 单细胞分离

由于篇幅原因，有限稀释法具体细节会在后面的文章单独讲解，请关注科研小助手后续文章。100 个细胞铺在一个大盘或 96 孔板中。剩余的细胞冻存。

10. 获得单克隆细胞株

当肉眼可见类似于菌落的细胞团时，将其从大盘或 96 孔板消化下来转移至 12 或 24 孔板中继续扩大培养。注意不要污染到其它细胞团，不要选取过密的细胞团。

11. 扩大培养，提取细胞全基因组 DNA 和细胞总蛋白

12. 测序

Guide 序列上游 100bp 左右和下游 200bp 左右为上下游设计一对引物，以全基因组为模板，以上述引物进行 PCR。PCR 产物送测序，或将产物用 T7E1 进行酶切消化检测突变。

13. Western

与阴性对照相比，靶基因应完全敲除