1.  当进行双标记实验时，最重要的准则是：第一抗体应为不同类型，从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。但如使用单克隆抗体，这一要求就有可能达不到，当使用单抗时，不同型的抗体如IgG和IgM，可被第二抗体确切区分。但不同亚类（IgG 1和IgG 2）的抗体通常不能被二抗确切区分。

2.  在试图进行双标记实验之前，应进行单标记实验，摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。

3. 在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。

组织切片做免疫荧光时，背景色重时的两种情况：

一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色；

二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色。

针对第一种问题有以下几点建议：1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光 2. 切片厚度减薄 3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光 4. 一抗以及二抗漂洗干净（非常重要） 5. 选用高品质封片介质。

针对第二种问题有以下几点建议：1. 曝光时间的控制 2. 暗室操作。