反向PCR
实验原理
实验材料
实验步骤
一、限制性内切酶消化
1. 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。
2. 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：
37℃ 过夜，电泳检测酶切效果。
二、回收DNA
1. 将酶切产物转到1.5 ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250 ul；
2. 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1 min；
3. 最大速度（13 000 rpm）离心1 min；
4. 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1 min；
5. 最大速度（13 000 rpm）离心2 min；
6. 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3 M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5 min；
7. 4℃最大速度（13 000 rpm）离心10~15 min；
8. 弃上清，尽量除去管壁上的液体；
9. 加入1 ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13 000 rpm）离心5 min；
10. 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40 ul ddH2O溶解。-20℃保存。
三、连接
1. 体系如下：
1. 体系如下：
2-14℃ 过夜
2. 连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48 h）。连接完成后，65℃ 水浴10 min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40 ul ddH2O中。
3. 然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
注意事项
1. 需要从许多酶中选择合适限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
2. 基因组DNA必须酶切完全。
3. 为提高分子间连接的效率，连接反应中DNA的浓度要低，因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平，从而产生非特异性扩增。
4. 成环的cDNA进行裂解和变性比较重要，因为环状双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应，它只可以扩增出较短的DNA片段。
5. 碱变性法已成功地用于制备PCR和测序DNA，该方法也可以有效地使环化的双链cDNA实现变性。
