混合淋巴细胞培养实验_实验⽅法

实验原理

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此外双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC）。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或³H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

实验步骤

1. 刺激细胞的准备

常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞（如N23细胞）或PBMC。

（1）取处于对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中。

（2）调整细胞数为1×10⁶/ml~2×10⁶/ml，移置于塑料培养瓶或者50 ml 离心管中。

（3）用60 ℃照射3000 rad。

2. 反应细胞的准备

分离纯化待检个体的PBMC。

3. LC

（1）按2×10⁶PBMC与1×10⁵经3000 rad照射的N23细胞的比例，重悬于4 ml 10%FCSRPMI1640。

（2）放置于小培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4 d 内不要晃动。

（3）第5 d 加入1 ml 新鲜培养基。

4. 如要测定³H-TdR掺入率，一般可在MLC的第5 d 进行。

5. 如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞（CTL），一般在7~10 d 左右收获效应细胞。

注意事项

1. 注意无菌操作。

2. 刺激细胞接受照射剂量要准确，是细胞暂时存活，但失去增殖的能力。

3. 可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。

4. 不同刺激细胞与反应细胞的合适比例有所不同，应做预实验选择最佳的实验条件。

实验方法

混合淋巴细胞培养实验