T、B淋巴细胞分离
实验原理
实验材料
实验步骤
(1)AET溶液的制备
称取AET粉剂402毫克,溶于10毫升蒸馏水中,使成为0.143 M 溶液,用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制,不宜久存。
(2) AET处理RRBC
取洗涤好压积的RRBC,按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟,每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口(1~2厘米)1800转/分离心5分钟。连续洗涤3-5次,每洗一次,必须充分摇匀,以减少AET-RRBC粘附成团,并观察有无溶血。若有溶血现象,则用含小牛血清的199培养基再洗一次,最后配成10%AET-RRBC悬液,置4℃保存,不得超过5天。
(3)1%AET-RRBC的配制:
将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET-RRBC,以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。
2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞,操作见后试验。
3. AET—E花环试验:
将分离的单个核细胞(2x106/毫升)与等量1%AET-RRBC混合,置37℃水浴15分钟,每隔5分钟摇匀一次,分装数管,每管2—3毫升,低速离心(1000转/分钟)5分钟后,移至4℃冰箱45分钟。
4. T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离
将形成E-花环的细胞悬液,再用淋巴细胞分层液分离,吸取界面云雾状的细胞,即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E-花环,用Hanks液洗一次后,加双蒸水3毫升处理3分钟,低渗裂解E-花环周围的RRBC,立即加3.5%氯化钠溶液1毫升,使还原为等渗,低速离心沉淀,即得富含T淋巴细胞群。
注意事项
1. 分离B细胞过程较长,为了避免B细胞自然死亡,在最后冲洗B细胞时可以用1640,而且要加入5一10%的小牛血清。
2. 每次洗涤时,不要将试管底部液体吸干,即防止压积的B细胞接触空气。
3. 使用抗B淋巴细胞血清与受检细胞按NIH方法进行微量B细胞毒试验,使用倒置相差显微镜读数。
其他
关于从小鼠脾脏中分离:
1.脾脏组织所含结缔组织比较少,可以直接在筛网上研磨,无需剪碎,也不用顾虑血管。
2.ficoll中含多聚糖,所以许多人喜欢把它放4度存放,是否室温对实验影响不大脾脏分离淋巴细胞实验比较简单,所以用普通的淋巴细胞分离液就行。
3 .离心2000rpm×20min,这步很关键,还有就是加细胞悬液时一定要贴壁缓慢加入,不要破坏分界面,分离液与细胞悬液我常用1:2,还有就是所选用的离心管粗细也会影响分层。
4.中间的悬浮白色环状细胞层即是所要的淋巴细胞层。
5.洗细胞主要是洗去分离液,所以不能省去。