1.  将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。

2.  在免疫琼脂板上按一定距离（1.2~1.5厘米）打孔，见图1。

图1  单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图

1~5孔加参考血清，6~7孔加待检血清

 

3.  向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。

4.  已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。

5.  测定各孔形成的沉淀环直径（mm），用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。