实验方法

DNA的酶切与连接

难度系数: 3.0

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DNA的连接和酶切可用于：（1）利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一；（2）成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。

质粒DNA酶切

实验原理

限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。

实验材料

标准pUC19（2686bp）

试剂/试剂盒

EcoRI及其配套的酶切缓冲液 0.5×TBE电泳缓冲液 6×Loading Buffer Goldview 琼脂糖

仪器/耗材

水平电泳仪 水浴锅 移液器 微波炉 成像设备

实验步骤

1.在200ul的离心管中，按照下表加入试剂（单位：ul），混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃保温2h进行酶切反应。


2.反应结束后，加入2ul  10x Loading Buffer钝化酶活性；（或：65℃，保温20min使酶失活）。

3.电泳检测。

酶切阴性对照：pUC19标样+10x Loading Buffer 2ul

酶切样品：标准pUC19酶切样品10ul + 10x Loading Buffer 2ul

4.质粒及酶切样品电泳预期结果。

注意事项

影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切（星号活性）。

其他

可以采用无缝克隆作为替代方案进行基因重组。

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