利用生物素标记引物
实验原理
1. 在微量离心管中混匀下列试剂，配制DNA摸板混合物
（5）加热至70℃，然后在30 min 以上的时间內，慢慢冷却至30 ℃
2. 当模板混合物冷却的同时，各取2 μl 小份的A、C、T、G引物终止混合液，加于4个独立的微量离心管或微量滴定板的孔中，然后做好A、C、G、T的标志。
3. 在65℃预热盛有终止混合物的管子或滴定板。
4. 加入1 μl Bst DNA聚合酶于步骤1冷却后的模板混合物中。
5. 步骤2准备好的每个引物终止混合物中，各加入2.5 μl 聚合酶/模板混合液，于65℃温育5 min。
6. 用水将20×追加溶液贮液稀释成1×追加溶液，往每个样品管或孔中各加入2 μl 1×追加溶液，于65℃温育5 min。
7. 各管或孔中加入4 μl终止溶液。
7. 各管或孔中加入4 μl终止溶液。
8. 准备好标准的0.2~0.4 mm 厚含8 mol/l 尿素的测序胶。
9. 加样前，样品于80℃温育2 min，置于冰浴，加样2~3 μl，电泳，监测示踪染料的迁移。
9. 加样前，样品于80℃温育2 min，置于冰浴，加样2~3 μl，电泳，监测示踪染料的迁移。
10. 剪三张与凝胶大小刚好或稍大的Whatman 3MM 滤纸，剪下一片能盖过凝胶需转移 区域的尼龙膜。
11. 拆卸凝胶装置，分开玻璃平板。
12. 将一张Whatman 3MM 干滤纸放于凝胶上，然后通过剥起滤纸小心将凝胶揭起。
13. 将贴着凝胶的滤纸，胶面朝上放在玻璃平板上。
14. 将尼龙膜浸没TBE缓冲液中，或用喷水瓶喷射TBE缓冲液使之完全润湿。
15. 小心将湿润的膜放在凝胶上，用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滚动以排去气泡。
16. 在膜的上面放两张Whatman 3MM 干滤纸，滤纸上放另一块玻璃平板并在其上加以2~4 kg 重物，转移1 h。
17. 分离测序胶/膜夹层，小心从凝胶上剥下膜，并用铅笔在膜与凝胶接触的一面作好标志，将膜放在滤纸上，晾干约10 min。
18. 使用紫外线交联装置，紫外透照仪或手恃式紫外灯，照射转印膜以固定DNA，总紫外线照量为120 MJ/cm2。
19. 接着进行步骤20的操作或将膜放在两层保鲜膜之间，在 4 ℃可保存6个月。
12. 将一张Whatman 3MM 干滤纸放于凝胶上，然后通过剥起滤纸小心将凝胶揭起。
13. 将贴着凝胶的滤纸，胶面朝上放在玻璃平板上。
14. 将尼龙膜浸没TBE缓冲液中，或用喷水瓶喷射TBE缓冲液使之完全润湿。
15. 小心将湿润的膜放在凝胶上，用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滚动以排去气泡。
16. 在膜的上面放两张Whatman 3MM 干滤纸，滤纸上放另一块玻璃平板并在其上加以2~4 kg 重物，转移1 h。
17. 分离测序胶/膜夹层，小心从凝胶上剥下膜，并用铅笔在膜与凝胶接触的一面作好标志，将膜放在滤纸上，晾干约10 min。
18. 使用紫外线交联装置，紫外透照仪或手恃式紫外灯，照射转印膜以固定DNA，总紫外线照量为120 MJ/cm2。
19. 接着进行步骤20的操作或将膜放在两层保鲜膜之间，在 4 ℃可保存6个月。
20. 将膜放入可加热封闭的大袋子中，加入500 ml 封阻液Ⅰ，小心排去气泡，密封口袋，放置10 min。
21. 按下述过裎处理膜
21. 按下述过裎处理膜
（1）200 ml 偶联物缓冲液20 min
（2）500 ml 封阻液15 min
（3）500 ml 洗涤缓冲液Ⅰ10 min，3次
（4）500 ml 分析缓冲液2 min
（5）50 ml 二氧杂环丁烷检测5 min
21. 从袋子中排出过量的检测液，平整所有的皱折，重新密封口袋。
22. 室温将包着的膜直接与X光感光片接触使之曝光。
实验材料
实验步骤
1. 在微量离心管中混匀下列试剂，配制DNA摸板混合物
（1）1 μg 单链DNA模板或1~3 μg 变性双链DNA模板
（2）0.5 pmol 生物素酰化DNA测序引物
（3）2 μl 5×Bst反应缓冲液
（4）加水至11 μl
（5）加热至70℃，然后在30 min 以上的时间內，慢慢冷却至30 ℃
2. 当模板混合物冷却的同时，各取2 μl 小份的A、C、T、G引物终止混合液，加于4个独立的微量离心管或微量滴定板的孔中，然后做好A、C、G、T的标志。
3. 在65℃预热盛有终止混合物的管子或滴定板。
4. 加入1 μl Bst DNA聚合酶于步骤1冷却后的模板混合物中。
5. 步骤2准备好的每个引物终止混合物中，各加入2.5 μl 聚合酶/模板混合液，于65℃温育5 min。
6. 用水将20×追加溶液贮液稀释成1×追加溶液，往每个样品管或孔中各加入2 μl 1×追加溶液，于65℃温育5 min。
7. 各管或孔中加入4 μl终止溶液。
7. 各管或孔中加入4 μl终止溶液。
8. 准备好标准的0.2~0.4 mm 厚含8 mol/l 尿素的测序胶。
9. 加样前，样品于80℃温育2 min，置于冰浴，加样2~3 μl，电泳，监测示踪染料的迁移。
9. 加样前，样品于80℃温育2 min，置于冰浴，加样2~3 μl，电泳，监测示踪染料的迁移。
10. 剪三张与凝胶大小刚好或稍大的Whatman 3MM 滤纸，剪下一片能盖过凝胶需转移 区域的尼龙膜。
11. 拆卸凝胶装置，分开玻璃平板。
12. 将一张Whatman 3MM 干滤纸放于凝胶上，然后通过剥起滤纸小心将凝胶揭起。
13. 将贴着凝胶的滤纸，胶面朝上放在玻璃平板上。
14. 将尼龙膜浸没TBE缓冲液中，或用喷水瓶喷射TBE缓冲液使之完全润湿。
15. 小心将湿润的膜放在凝胶上，用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滚动以排去气泡。
16. 在膜的上面放两张Whatman 3MM 干滤纸，滤纸上放另一块玻璃平板并在其上加以2~4 kg 重物，转移1 h。
17. 分离测序胶/膜夹层，小心从凝胶上剥下膜，并用铅笔在膜与凝胶接触的一面作好标志，将膜放在滤纸上，晾干约10 min。
18. 使用紫外线交联装置，紫外透照仪或手恃式紫外灯，照射转印膜以固定DNA，总紫外线照量为120 MJ/cm2。
19. 接着进行步骤20的操作或将膜放在两层保鲜膜之间，在 4 ℃可保存6个月。
12. 将一张Whatman 3MM 干滤纸放于凝胶上，然后通过剥起滤纸小心将凝胶揭起。
13. 将贴着凝胶的滤纸，胶面朝上放在玻璃平板上。
14. 将尼龙膜浸没TBE缓冲液中，或用喷水瓶喷射TBE缓冲液使之完全润湿。
15. 小心将湿润的膜放在凝胶上，用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滚动以排去气泡。
16. 在膜的上面放两张Whatman 3MM 干滤纸，滤纸上放另一块玻璃平板并在其上加以2~4 kg 重物，转移1 h。
17. 分离测序胶/膜夹层，小心从凝胶上剥下膜，并用铅笔在膜与凝胶接触的一面作好标志，将膜放在滤纸上，晾干约10 min。
18. 使用紫外线交联装置，紫外透照仪或手恃式紫外灯，照射转印膜以固定DNA，总紫外线照量为120 MJ/cm2。
19. 接着进行步骤20的操作或将膜放在两层保鲜膜之间，在 4 ℃可保存6个月。
20. 将膜放入可加热封闭的大袋子中，加入500 ml 封阻液Ⅰ，小心排去气泡，密封口袋，放置10 min。
21. 按下述过裎处理膜
21. 按下述过裎处理膜
（1）200 ml 偶联物缓冲液20 min
（2）500 ml 封阻液15 min
（3）500 ml 洗涤缓冲液Ⅰ10 min，3次
（4）500 ml 分析缓冲液2 min
（5）50 ml 二氧杂环丁烷检测5 min
21. 从袋子中排出过量的检测液，平整所有的皱折，重新密封口袋。
22. 室温将包着的膜直接与X光感光片接触使之曝光。
