皮下种植法
实验原理
实验材料
实验步骤
一、细胞培养
1. SUDHL-4为人GCB 样DLBCL细胞株。将初始密度为2.5x105 /ml 细胞置于含10% FBS、100 U /ml 青霉素、100 ug/ml 链霉素、30 ug/ml 谷氨酰胺的RPMI1640 培养液的T25 细胞培养瓶中,在37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。
2. 待2-3 d 第1 次传代后,转入T75 细胞培养瓶,以后根据细胞生长情况适时移入T150 细胞培养瓶。
2. 待2-3 d 第1 次传代后,转入T75 细胞培养瓶,以后根据细胞生长情况适时移入T150 细胞培养瓶。
二、流式细胞术检测样品的制备
1. 取对数生长期的SUDHL-4 细胞,用无血清PBS 漂洗2 遍后,于PBS /2% FBS 中制成细胞悬液( 1 x107 /ml) 。
2. 根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体,4℃避光孵育15 min;若需胞内染色,则先采用1% 多聚甲醛对细胞进行固定,然后用破膜剂( 0.25% Saponin) 处理,同时加抗体进行染色,4℃避光孵育过夜。
3. 细胞用PBS /2% FBS 漂洗1遍,悬于200 ul PBS 待测。
4. 流式细胞仪检测时每份样品均测定3x105 细胞,用FlowJo 软件对检测结果进行分析。
2. 根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体,4℃避光孵育15 min;若需胞内染色,则先采用1% 多聚甲醛对细胞进行固定,然后用破膜剂( 0.25% Saponin) 处理,同时加抗体进行染色,4℃避光孵育过夜。
3. 细胞用PBS /2% FBS 漂洗1遍,悬于200 ul PBS 待测。
4. 流式细胞仪检测时每份样品均测定3x105 细胞,用FlowJo 软件对检测结果进行分析。
三、实验动物
1. SPF 级SCID 小鼠,雌性,5 周龄,体重16-20 g随机分组,饲养及实验均在恒温( 20 - 26℃) 、恒湿( 50% -56%) 的SPF 级鼠房内进行。
2. 小鼠置于层流架带盖鼠盒中,空气经中效过滤,喂食标准颗粒饲料,与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。
2. 小鼠置于层流架带盖鼠盒中,空气经中效过滤,喂食标准颗粒饲料,与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。
四、细胞接种
1. 取对数生长期的SUDHL-4 细胞,用无血清PBS 漂洗2 遍后,悬浮于无血清PBS。
2. 实验组小鼠( 每组10 只) 在其一侧肋部皮下接种0.1 ml 含107 细胞的细胞悬液; 2 个成瘤对照组分别为每组3 只,在右侧肋部皮下接种0.1 ml 分别含5 × 106 细胞和1 x106细胞的细胞悬液; 正常对照组( 每组10 只) 在右侧肋部皮下注射0.1 ml PBS。
3. 接种前小鼠不经任何处理。
2. 实验组小鼠( 每组10 只) 在其一侧肋部皮下接种0.1 ml 含107 细胞的细胞悬液; 2 个成瘤对照组分别为每组3 只,在右侧肋部皮下接种0.1 ml 分别含5 × 106 细胞和1 x106细胞的细胞悬液; 正常对照组( 每组10 只) 在右侧肋部皮下注射0.1 ml PBS。
3. 接种前小鼠不经任何处理。
五、荷瘤鼠指标检测
1. 实验期间每日观察小鼠一般情况、成瘤及肿瘤生长情况。
2. 每日测量体重和肿瘤长短径和高度,并计算肿瘤体积( 计算方法:π/6 x 长x 宽x 高) ;当瘤体达到1 200 mm3 时视为人道终点。
3. 小鼠经麻醉并拉颈处死后,先观察体表各部位成瘤情况;然后解剖动物,观察各内脏器官和淋巴结转移情况。
4. 取下肿瘤,置于10%中性福尔马林溶液固定,常规石蜡切片,HE 染色观察。
2. 每日测量体重和肿瘤长短径和高度,并计算肿瘤体积( 计算方法:π/6 x 长x 宽x 高) ;当瘤体达到1 200 mm3 时视为人道终点。
3. 小鼠经麻醉并拉颈处死后,先观察体表各部位成瘤情况;然后解剖动物,观察各内脏器官和淋巴结转移情况。
4. 取下肿瘤,置于10%中性福尔马林溶液固定,常规石蜡切片,HE 染色观察。
六、统计学处理
实验数据以均数± 标准差( X± SD) 表示,采用SPSS11.5 统计软件包处理,各组样本均数比较采用单因素方差分析( ANOVA) 。