一、实验目的

1、掌握质粒DNA 分离，纯化的原理。

2、学习煮沸法快速提取质粒DNA 的方法。

3、学习DNA的限制性酶切的基本技术。

4 、学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度。

二、实验原理

在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA 序列，在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基化程度等。

对DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料- 溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。

用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp 至近50kbp 的DNA 。长度100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。

DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

三、实验材料和试剂

1. 菌种

含pUC18 的大肠杆菌JM107 菌株。

2. 化学试剂和溶液

　　（1） LB 培养基：
　　NaCl 10g/l 酵母提取物5g/l
　　胰蛋白胨10g/l 氨苄青霉素50 μ g/ml （培养基灭菌后加入）
　　pH7.0

　　（2） 70% 乙醇（-20 ℃）及无水乙醇（-20 ℃）

　　（3） STET 缓冲液（pH8.0 ）（8% 蔗糖，0.5%Triton，50mmol/L EDTA，10mmol/L Tris ）

　　（4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨）

　　（5） 1.2M 氯化钠

　　（6） TE 缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA ）

　　（7） 电泳缓冲液（50XTAE ）

　　Tris 242g， 冰醋酸57.1ml，EDTA（0.5mol/LpH8.0） 100ml
　　使用时用蒸馏水稀释50 倍。

　　（8） 样品缓冲液（6X ）

　　0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖

　　（9） 溴化乙锭10mg/ml

　　（10） 琼脂糖（电泳级）

　　（11） 限制性内切酶

　　（12） 溶菌酶（50mg/ml ，溶于10mmol/L Tris-HCl ，pH 8.0 ）

3.仪器设备

　　台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。

　　Eppendorf 离心管，Tip 头，三角瓶等灭菌备用。

　　电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（20ul，200ul 和1000ul ），离心管，Tips（200ul，1000ul）。

四、操作步骤：

1.质粒提取

(1) 将2ml 含相应抗生素的LB 培养基加入到容量为15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在37 ℃剧烈震荡（250rpm）培养过夜。 
　　(2) 将1.5ml 培养物转入离心管中，用台式离心机在4 ℃条件下离心30 秒（12,000 × g）。 
　　(3) 弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于200 m l STET 缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。 
　　(4) 加入4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下5min 。 
　　(5) 用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45 秒，取出后立刻离心10min。 
　　(6) 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8 m l 5%CTAB ，用混合器混匀后，高速离心5min，弃上清液,用滤纸吸干离心管中的液体。 
　　(7) 加入1.2M 氯化钠300 m l，充分溶解沉淀物，再加入750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心15min ，弃上清液。 
　　(8) 取1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心5min。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min。
　　(9) 沉淀物溶于50 m l TE 缓冲液中，混合器混匀。
　　(10) 即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用。

2.DNA的酶解

设置DNA的酶切反应，按下列顺序加样（体积：ml）：
　　　　　　　　反应管　　对照管
　　制备的质粒　DNA 　　　22
　　酶反应液　　（10'）　　22
　　双蒸水　　　　15　　　16
　　限制性内切酶　（5U）　10
　　总体积　　　　20　　　20

 加完反应液，混匀，离心1分钟，置于37℃水浴中，反应2小时。加入加样缓冲液（10 ′）2 ml。

3. 质粒DNA的琼脂糖电泳

(1) 量取100毫升TAE电泳液，加入0.7克琼脂糖，混匀后，置于微波炉中，加热3分钟，充分溶解琼脂糖。注意观察，当心煮沸的液体溢出。
　　(2) 用灭菌后的橡皮胶，封闭清洁干燥的电泳板，并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子，调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离，一般以1-2毫米为宜。 
　　(3) 当溶解后的琼脂糖液冷却至50℃左右时，加入溴化乙锭5 ml，溴化乙锭的最终浓度为1.0 mg/ml，混匀后，将琼脂糖液倒入电泳板中，静止，切勿移动。 
　　(4) 在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟），轻轻地取出梳子，除去胶带，将凝胶放入电泳漕中。 
　　(5) 电泳漕中加入电泳液（1 ′TAE），使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。 
　　(6) 取上一实验制备的质粒提取液（酶切），加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物（marker），对照以及质粒提取液（酶切）样品。
　　(7) 接通电源，在90V下，电泳1小时，当溴酚兰颜料迁移至凝胶前沿时，切断电源。  
　　(8) 取出凝胶，在紫外灯下观察DNA的迁移位置，并讨论实验结果。

五、注意事项：

(1) 从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时，一定要彻底，不能留有残余。 
　　(2) 用70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心，防止将核酸同洗液一起去掉。 
　　(3) 在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌。 
　　(4) 酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。 
　　(5)进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头。 操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。
　　(6) 溴化乙锭是一种强烈的致癌物质，使用时必须带手套。实验结果后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。