导读

在本篇论文中您将了解：

• 如何制备 PBMC 和裂解红细胞进行流式细胞染色；

• 如何使用 DuraClone 进行 PBMC 中的 T 细胞受体流式分析用 DuraClone 通过流式细胞术实施；

• 使用 CytoFLEX 流式细胞仪和 DuraClone 识别 TCR 亚群。

实验简介

T 细胞在免疫系统的功能和调节中起关键作用。成熟 T 细胞可表达 CD3 和 T 细胞受体（TCR）。

它们可以根据其 TCR 类型进一步分为两个亚群：αβ T 细胞（T 细胞库的 95%）和 γδ T 细胞（T 细胞库的 5%）。经过与 MHC I 类分子和 MHC II 类分子的亲和力选择， TCR αβ T 又分化为 CD4 T 细胞或 CD8 T 细胞。

γδ T 细胞的最大亚群可表达 Vδ2 TCR 复合体，而较小的亚群可表达 Vδ1 TCR 复合体。研究发现 TCR γδVδ2 T 细胞和 TCR γδ Vδ1 T 细胞在母胎耐受 1 和同种异体移植耐受 2 中发挥重要作用。多种 T 细胞亚群的相互作用对于各种正常和病理学研究很重要。

DuraClone IM Pannels 被制备成室温下稳定的干粉状标准化混合试剂。试剂组合方案是基于 One Study 研究以及多家专业临床研究型流式实验室共同设计完成的。在这里我们展示了正常人 PBMC 应用 DuraClone IM TCR 管在 CytoFLEX 上的检测结果。

方法

外周血单核细胞（PBMC）分离

将 10 毫升全血用 1X PBS + 3 ％ FCS 稀释至 21 mL。 将 6 mL Ficoll（Sigma：Histopaque 1077 目录号 10771）加入三个 15 mL 锥形小瓶中。通过用 10 mL 移液管以非常陡的角度将 7 mL 稀释的血液加入到 Ficoll 中。

然后将稀释的血液缓慢加入覆盖在 Ficoll 上面。将细胞在 1500 RPM 下离心 30 分钟。吸出上清液，将样品合并， 并用 PBS + 5％ FCS 洗涤。将细胞沉淀重新悬浮，使用 ViCell 计数，然后稀释至每管的终浓度为 1 x 106 细胞/100 µL，用于染色。

DuraClone 染色步骤

将 100 万个 PBMC 加入 DuraClone IM TCR 管中，然后涡旋 5 秒。在室温下在避光孵育 20 分钟后，用 3 mL PBS 洗涤 PBMC，然后在 400 g 力下离心分离 5 分钟。将 PBMC 重新悬浮于 250 µL 的 PBS 中，然后在 CytoFLEX 上采集数据。

结果

用 DuraClone IM TCR 管快速进行 TCR 亚群检测

正常 PBMC 使用 DuraClone IM TCR 管进行染色并在 CytoFLEX 上进行分析，能够实现快速的 T 细胞亚群检测。大约 30 分钟时间， PBMC 便被精确地按照其表型特征划分为不同亚群。使用 DuraClone IM TCR 管是复杂的染色步骤的可行替代方案。

参考文献

1. Pregnancy and gamma/delta T cells: taking on the hard questions. Mincheva-Nilsson L. Reprod Biol Endocrinol. 2003 Dec 2; 1:120.Review。

2. Characteristics of Vδ1 (+) and Vδ2 (+) γδ T cell subsets in acute liver allograft rejection. Yu X, Liu Z, Wang Y, Wang H, Zhang M, Sun Y, Su H, Jin L, Wang F, Shi M. Transpl Immunol. 2013 Dec; 29(1- 4):118-22.

注释

本应用说明中所示的结果均 Beckman Coulter CytoFLEX 流式细胞仪上检测产生。由于分析仪之间的性能存在差异，作者不能保证使用的其他流式细胞仪具有类似的外观。

试剂详细信息

试剂	供应商	订购详细信息
DuraClone IM TCR 管	Beckman Coulter	B53340
淋巴细胞分离液	Corning	25-072-C1
DPBS, 1X (Dulbecco 的磷酸 盐缓冲液	Corning	21-031-CV

通过 CD45 染色 PBMC 上圈出淋巴细胞群 体（A）。CD3+ 淋巴细胞（B）基 于 TCR γδ 或 TCR αβ 的表达又被分为两群（C）。在 γδ T 细胞中，根据 Vδ1 和 Vδ2 的表达被分为两个亚群（D）。在 αβ T 细胞中，根据 CD8 和 CD4 的表达分为两个亚群（E）。

作者：Michael McPherson, Karen Carr, Si-Han Hai .

附属机构：贝克曼库尔特