各种限制性内切酶；T DNA连接酶、无DNA酶的RNA酶和100 bp DNAMarker；Klenow酶；

Lambda DNA HindIll Marker；Trizol试剂、Taq DNA聚合酶和琼脂糖；酵母抽提物、胰蛋白胨；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA分离纯化试剂盒；Lipofectamine 2000阳离子脂质体、Opti-MEM、DMEM培养基和M-MLV逆转录酶；小牛血清；G418；DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I1。

采用Hindin和EcoRI消化pCL，获得800 bp的人13-IFN基因上游IFN-MAR，将此片段克隆至pBluescript中，构建重组质粒载体pBlue-MAR。再将MAR片段经SalI和XbaI双酶切插入pGL3-EBVR的EBVR片段下游，构建pGL3-EBVR-MAR。

经Hind Ill消化，Klenow酶补平，将5．3 kb的EBVR-MAR片段亚克隆入pcDNA3中CMV启动子上游Bgl I1与Ⅳ，MI位点之间，构建重组质粒载体pcDNA3-EBVR-MAR。

将聚合酶链反应(PCR)扩增所得的EGFP片段插入pcDNA3-EBVR-MAR的Hind11I和XhoI之间，得到重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR-MAR。经MfeI和EcoRI消化去除OriP片段，T 连接酶连接，构建得到重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBNA1MAR。

细胞株COS-7在含10％ 小牛血清的DMEM培养液、5％CO 、37℃ 恒温箱中培养。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导质粒pcDNA3-EGFP.EBVR和pcDNA3.EGFP.EBNA1.MAR转染细胞COS.7。

具体操作参照产品说明书。48 h后检测目的基因表达或以1：20传代后加入G418(400 g／mL)筛选，每2～3天换液1次。10～14 d后抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆细胞。分别在转染后14、28、60 d检测目的基因表达。

3．逆转录(RT)-PCR检测EGFP cDNA转录：细胞转染后14、28、60 d采用Trizol试剂抽提细胞总RNA。具体操作参照产品说明书。DNase I孵育去除残留的基因组DNA，紫外分光光度计定量后，以GAPDH基因片段作为内参照，RT．PCR检测EGFPmRNA转录。

EGFP引物：上游：5’GCGAAGCTTCCATGGTGAGCAAGGGC 3’；下游：5’CCAGGATCCGCCGC 兀TACTTGTAC 3’；扩增片段长度为719 bp。

GAPDH 弓I物上游：5’TGGGGAAGGTGAAGGTCGG3’；下游：5’CTGGAAGATGGTGATGGGA 3’；扩增片段长度为233 bp。PCR扩增条件：95℃ 5 min后，94 ℃ 1min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。

按照Hirt’S方法 在转染后14、28、60 d抽提COS．7细胞内小分子DNA。

具体方法：用10 mmol／L Tris．HC1(pH 7．5，1 mmoI／L EDTA，1％ SDS，200 g／mL Pro—teinase K)1 mL裂解5×10。个细胞，37℃ 保温2 h；裂解细胞液内加入5 mol／L NaC1 0．25 mL，轻轻混匀，4℃ 过夜；4℃ 离心，15 000×g 30 min；取上清，酚一氯仿抽提，乙醇沉淀，20 TE液(pH 8．0，10 mmol／L Tris—HC1，1 mmoI／L EDTA，25 g／mL无DNase的RNase)溶解。

为了鉴定获得的Hirt’S小分子DNA的完整性，取出5 μL，电穿孑L法转化大肠杆菌JM109，还原质粒。观察所得细菌克隆数，并挑取转化克隆质粒小量制备。以原始质粒作为对照，适当限制性内切酶酶切，0．8％ 琼脂糖凝胶电泳鉴定。