各位好，拜托大家给点建议
我最近在做FCM，主要是测药物对黑色素肿瘤细胞的生长周期的影响，用的方法是FCM PI染色的方法。
但是70%的乙醇固定之后，离心后可以看到有大量的细胞贴壁，把上清吸出去以后，可以看到沉淀留在底部，但是加入了PBS吹打均匀以后再离心。不管怎么样延长时间，或加大转速，就是没有细胞离到壁上，请问大家，这是怎么回事。应该如何避免上面这样的问题出现呢？！

固定的时候出问题了
细胞估计已经破裂
固定时候应该缓慢添加固定液
有的时候固定液就是用PBS和无水乙醇配置的。

我做的步骤：接种适当浓度细胞于培养皿中，培养过夜后，经0.25%胰蛋白酶消化,冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后离心,用70%(体积分数)预冷乙醇悬浮细胞于-20度固定过夜后,离心收集细胞,用PBS洗3次去除乙醇,细胞团重悬于PBS中,用20 μg/ml含RNaseA的碘化丙啶PI染色液避光染色30 min,经100目尼龙网过滤后进行FCM 检测。

根据你出现的问题做的推测：
1、离心速度是否过大导致细胞破裂？
2、PBS和乙醇溶液没错？