实验方法

【求助】凋亡抑制基因

2015-09-22 09:38

我现在手上有一个携带杆状病毒一凋亡抑制基因(此基因属于凋亡抑制基因家族成员,其家族其它已发现的成员均在人肿瘤组织中有表达,并具有或多或少的临床意义,这是我们选择此基因的依据)的质粒,在昆虫细胞中证实此基因具有抑制凋亡的功能。我准备做如下实验:质粒扩增、转染入肺癌细胞株,验证其是否具有抑制肺癌细胞凋亡功能,如果有表达,则继续行动物实验验证,最后一步检测其在人肺癌标本中的蛋白表达及其与临床病理特征之间的关系。
问题:此病毒基因仅仅在昆虫细胞(夜蛾)证实有凋亡抑制功能,直接转染入人肺癌细胞株,如果有表达,其表达是否有意义?就能证明其也是人肺癌细胞中的凋亡抑制基因?这种方式是否过于简单?缺乏严谨性?如果是作为一种新基因研究,是否有更合理的方式?
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好久都没来了,都毕业了,有时间还得来学习学习
虽然不会,也了解了一下,先沙发了
结合我自己的思路说一点建议和经验。
首先,站友的实验基本思路是常规的,有了目的基因然后转入相应细胞,这里我要说一声按照你的问题“这样转染以后是否就能证明你想要证明的结果?”这就要分为两个方面了。
第一,你要转肺癌细胞是不能只转一种肺癌细胞的,至少要有三种肺癌中已经明确的癌细胞才行。
第二,仅仅只是转入肺癌中也是不够的,必须要有你转入其他肿瘤细胞中的数据,哪怕是转入以后在其他癌症细胞中没有表达或者表达量不是很高,表达丰度不是很明显,但是要有这样的数据,如果有表达自然更有说服性,没有的话就必须有后续实验来证明这只是在肺中表达,这种情况下要做特异性的实验,至于实验方法只能看看相关文献了。
其次,前面的实验都完成了,并且你所选择的基因在靶细胞里是有表达那么证明这样的表达是有继续研究的意义的,就像冰山挖开了一角,你既不能说这就肯定是山了,也不能确定它不是山,只能说这是一块大冰,但全部挖开就很有可能是一座冰山,这就是研究的目的,所有的科研不可能是知道明确的结果才去研究,研究自然是研究未知但有理论可能的东西,继续下面的工作来彻底挖开它,比如用KNOCK DOWN,和正常细胞,没干扰过的癌细胞,分别做对照,通过DNA水平,蛋白水平,和免疫组化等在多方面来说明问题,如果都行,都有结果,接着继续做癌细胞的侵袭,生殖和转移变化实验,若一切都是阳性估计就直接进入动物实验了,根据相关的标准建模,剩下的就太复杂了,估计在学生期间不可能把动物实验完整做完的,这里的动物实验不是指随便养几十只老鼠,去组织或者提RNA来看表达量什么的,要做体内抑瘤生长实验等等这个一般是要和公司联合做的,把基因直接转入受精卵,然后培养动物,在观察结果。
最后,实验必须要有全面的严谨的思路不能一蹴而就,连自己都不明白实验的目的,自然就常常不知道下一步要干什么,这样做了行不行,所以要多思考和总结,搞基础其实也就是摆弄思路,然后用实验来证实结果而已,希望能对你的实验有所帮助.
谢谢,学习了
ysh2006 wrote:
我现在手上有一个携带杆状病毒一凋亡抑制基因(此基因属于凋亡抑制基因家族成员,其家族其它已发现的成员均在人肿瘤组织中有表达,并具有或多或少的临床意义,这是我们选择此基因的依据)的质粒,在昆虫细胞中证实此基因具有抑制凋亡的功能。我准备做如下实验:质粒扩增、转染入肺癌细胞株,验证其是否具有抑制肺癌细胞凋亡功能,如果有表达,则继续行动物实验验证,最后一步检测其在人肺癌标本中的蛋白表达及其与临床病理特征之间的关系。
问题:此病毒基因仅仅在昆虫细胞(夜蛾)证实有凋亡抑制功能,直接转染入人肺癌细胞株,如果有表达,其表达是否有意义?就能证明其也是人肺癌细胞中的凋亡抑制基因?这种方式是否过于简单?缺乏严谨性?如果是作为一种新基因研究,是否有更合理的方式?
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我觉得关键是检测肺癌细胞株有没有表达该同源基因,有表达才有意义,有表达可以做基因沉默,可以与临床联系起来。
如果不表达,做转染好象意义不大,最后无非证明是否在肺癌中有没有抑制凋亡的作用,而且别人也已证明该基因有抑制凋亡作用了。

不知道你有没有弄反,如果该基因是促凋亡作用即使肺癌组织没表达该内源基因,转染还是有意义的(有抑癌作用,可以用于肿瘤治疗,如基因治疗)。

不管是抑凋亡还是促凋亡,最好先检测肺癌中有没有该内源基因表达。

PS:仅代表个人观点,敬请拍砖!:)

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