市售醋酸纤维薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面,其目的是选择膜片厚薄及均匀度,如漂浮15 s~30 s 时,膜片吸水不均匀,则有白斑点或条纹,这提示膜片厚薄不匀,应舍去不用,以免造成电泳后区带扭曲,界线不清,背景脱色困难,结果难以重复。
由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小,浸泡30 min 以上是保证膜片上有一定量的缓冲液,并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉,这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。
点样时,应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染,取膜时,应戴指套或用镊子。
醋酸纤维薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液,其浓度为0.05 mol/L~0.09 mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时,先初步定下某一浓度,如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm~10 cm,则需电压25 V/cm膜长,电流强度为0.4 mA/cm~0.5 mA/cm膜宽。
当电泳达不到或超过这个值时,则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽;缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨。
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则,检测方法越灵敏,加样量则越少,对分离更有利。如加样量过大,则电泳后区带分离不清楚,甚至互相干扰,染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时,每厘米加样线上需加样品0.1 μl~0.5 μl约相当于5 μg~1000 μg蛋白。
血清蛋白常规电泳分离时,每厘米加样线加样量不超过1 μl,相当于60μg~80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时,加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一,以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
电泳过程应选择合适的电流强度,一般电流强度为0.4 mA/cm~0.5 mA/cm宽膜为宜。电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增加,造成膜片干涸。电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散。
对醋酸纤维薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力,背景易脱色;应尽量采用水溶性染料,不宜选择醇溶性染料,以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色时间。时间长,薄膜底色深不易脱去;时间短,着色浅不宜区分,或造成条带染色不均,必要时可进行复染。
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