译自：Valerio, et al. Maldi-TOF analysis of portal sera of pancreatic cancer patients: identification of diabetogenic and antidiabetogenic peptides. Clinica Chimica Acta, 2004, 343:119-127
约80％患者在诊断胰腺癌时合并糖尿病，其原因及病理生理机制目前仍未明确。胰腺癌合并糖尿病的患者胰岛素分泌改变和外周胰岛素抵抗两者至少存在其一或同时存在。体内外动物实验已经证明胰腺癌细胞可以改变肝脏、骨骼肌组织的糖代谢，肝脏、骨骼肌和脂肪组织是胰岛素调节葡萄糖分布作用的主要靶器官。另外我们已经证明胰腺癌细胞还可以改变大鼠分离和灌注肝细胞的糖酵解，证据是乳酸盐产物水平下降，合并α-甘油磷酸盐代谢通路加强，其特征为1,2-DAG产物水平上升。因此我们认为代谢异常可能发生在丙糖水平，并可能涉及酶的活性和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的翻译。
虽然许多研究已经证实胰腺癌合并糖尿病的分子因素是低分子量的肿瘤细胞可溶产物，有可能是肽类，但是具体因子还未明确。这些因子作用于肝脏细胞，也可能作用于骨骼肌细胞和胰岛素分泌细胞。另外，为了明确是否存在与胰腺癌合并糖尿病相关的特征分子，我们分析了胰腺癌合并糖尿病患者和胰腺癌不合并糖尿病患者外周血中的低分子量肽谱，但是从外周血得到的结果可能与胰腺癌的产物不能准确吻合，这是因为来源于胰腺的血液首先经肝脏代谢。如果直接分析门静脉血，就能得到胰腺癌典型产物释放的直接信息，可能会解决这个问题。
胰腺癌合并糖尿病的另一个研究领域是致糖尿病产物与肝脏、骨骼肌等靶器官取得联系后的细胞内激活机制。我们认为在这个过程中NO起重要作用，理由如下：(1)有研究报道NO在骨骼肌中有胰岛素样作用；(2)胰岛素抵抗患者NO水平升高；(3)NO可干扰肝细胞的葡萄糖输出和糖原合成；(4)NO在LPS诱导高血糖症的病理生理机制中起重要作用。
因此本研究的目的是：(1)分析伴或不伴糖尿病的胰腺癌患者肝脏组织匀浆中的GAPDH酶活性和mRNA水平；(2)验证这些患者肝脏组织的NO水平是否改变；(3)用MALDI-TOF技术分析胰腺癌患者门静脉血的蛋白/肽谱型。
方 法
1. 患者 共纳入23位患者，17位为接受过手术的胰腺癌患者（男性7位，女性10位，年龄范围57岁~86岁），6位为慢性胰腺炎患者（男性5位，女性1位，年龄范围48岁~72岁），所有患者均经组织学检查确诊。在接受胰腺外科操作之前，所有患者取2份无肿瘤转移的肝脏样本，12位胰腺癌患者还取到了门静脉血样。组织样本马上冰冻，在为了作GAPDH mRNA定量或生化检测而进行RNA提取或匀化前贮存于−80°C条件下，时间不超过1月。门静脉血清以3000×g离心5分钟，在进行质谱分析前贮存于−20°C条件下，时间不超过3月。糖尿病诊断根据空腹血糖浓度高于7.0mmol/L，或根据口服糖耐量试验诊断。
2. 细胞系和细胞培养 MIA PaCa2和PANC-1（来源于人原发性胰腺腺癌）、CAPAN-1（来源于人胰腺转移癌）和正常人纤维母细胞（来源于接受隐静脉切除术者的被切除的隐静脉）在培养基中进行培养，培养基中含低糖（5.5 mM）DMEM、10％FCS、2％谷酰胺和0.1％庆大霉素。细胞（约100,00/每烧瓶）接种于含10ml DMEM的75cm2烧瓶内，培养6天后，取出培养基并以200×g离心10分钟，收集上清液（条件培养液）作质普分析备用。
3. GAPDH m-RNA定量 1份肝脏组织样本用柱层析法提取mRNA，取3mg提取的mRNA反转录入cDNA，然后用cDNA作为试剂盒的启动模板进行GAPDH mRNA定量。
4. 肝脏组织匀化 另1份肝脏组织样本用于生化检测，首先取30mg在500μl 水中匀化，其中包含胃酶解血管紧张肽、抑糜蛋白酶素等蛋白水解酶抑制剂。然后检测匀浆中的GAPDH酶活性、葡萄糖、乳酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐水平。
5. GAPDH的酶活性测定 组织匀浆在4°C条件下以35000×g离心30分钟，取40μl上清液与600μl pH值为7.6的缓冲液一起培养，缓冲液中包括82.3mM三乙醇胺、1.1mM ATP、6.2mM三磷酸甘油酯、0.9mM EDTA、0.2mM NADH和2mM硫酸镁等。每单位GAPDH酶活性用1 mmol NADH每分钟的氧化作用换算，以每分钟的Abs 340 nm变化表示（Δ/min）。
6. 硝酸盐/亚硝酸盐水平测定 肝脏的硝酸盐/亚硝酸是NO氧化的最终产物，用光度终点法测定肝组织匀浆的硝酸盐/亚硝酸盐水平，结果用Abs 540 nm表示。
7. 萄萄糖和乳酸盐水平测定 用比色法自动分析仪检测肝组织匀浆的萄萄糖和乳酸盐水平。
8. MALDI质谱分析 MALDI质谱用装备SCOUT 离子源的REFLEX飞行时间仪进行检测。离子由加速至25 kV的脉冲UV激光束产生（氮激光，λ＝337 nm）。在进行MALDI-MS分析前，非条件培养液（DMEM+10％FCS）、所有的细胞系条件培养液和血清稀释样本（1:3生理盐水稀释）须进行超滤，然后用Millipore过滤器透析2小时（孔径0.45μm）。血清样本还要用微孔过滤器过滤2小时（孔径0.45μm）。要检测低分子量肽片段须用经超滤的样本，而检测高分子量肽片段用未超滤的样本即可。5ml样本溶液与5ml基质溶液混合，取1ml混合液贮存于不锈钢容器中作质谱分析。外部质定标用质荷比（m/z）分别为5734和2867的牛胰岛素的[M+H]+和[M+H]2+离子。为了验证分析的精确性，每份样本进行3次独立分析。
9. 统计分析 统计分析采用Student’t检验、Wilcoxon检验和Fisher精密检验，小于5％为显著性检验标准。
结 果
胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者间肝脏组织乳酸盐、葡萄糖、亚硝酸盐、硝酸盐、GAPDH酶活性和GAPDH mRNA复制6个参数均无显著差异。胰腺癌伴糖尿病患者肝脏乳酸盐、葡萄糖、亚硝酸盐和GAPDH mRNA平均水平高于无糖尿病的胰腺癌患者。胰腺癌患者GAPDH mRNA复制水平与空腹血糖浓度（r=0.78，P＜0.001）、肝脏GAPDH酶活性（r=0.508，P＜0.05）和肝脏乳酸盐水平（r=0.654，P＜0.01）均存在相关性。肝脏葡萄糖水平与肝脏乳酸盐水平存在相关性（r=0.913，P＜0.001）。
非条件培养基和所有的细胞系条件培养基有20个共同片段，9个片段只存在于细胞培养基，不存在于非条件培养基，28个片段只存在于胰腺癌细胞系条件培养基。
胰腺癌患者门静脉血清中有172个片段，m/z值从1098到150078，其中某些片段存在联系。片段11748 m/z、12636 m/z和16011 m/z相互间存在正相关性（11748 m/z和12636 m/z：Fisher精密检验P＜0.05；11748 m/z和16011 m/z：Fisher精密检验P＜0.01）。片段2554 m/z和5020 m/z间存在正相关性（Fisher精密检验P＜0.01）。片段5002 m/z和3285 m/z、5020 m/z间存在负相关性（Fisher精密检验P＜0.05）。
根据是否伴糖尿病对患者进行分组，发现糖尿病和片段5002 m/z的存在以及片段2554 m/z、11748 m/z、11748 m/z、12636 m/z、16011 m/z的缺乏存在显著关联性（各项Fisher精密检验均P＜0.05）。糖尿病和片段3285 m/z（P=0.088）、5020 m/z（P=0.088）间存在负性关联，但不具统计学意义。
片段11748 m/z和16011 m/z与肝脏硝酸盐水平间都存在负相关性（Wilcoxon W=10，P＜0.05）。
结 论
与肝脏GAPDH不同，NO参与了胰腺癌合并糖尿病的过程。在门静脉血清中，是某些特殊片段/肽的缺乏而不是存在与糖尿病的发生存在关联。
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http://www.dxy.cn/bbs/user/download/1818598/45.pdf
约80％患者在诊断胰腺癌时合并糖尿病，其原因及病理生理机制目前仍未明确。胰腺癌合并糖尿病的患者胰岛素分泌改变和外周胰岛素抵抗两者至少存在其一或同时存在。体内外动物实验已经证明胰腺癌细胞可以改变肝脏、骨骼肌组织的糖代谢，肝脏、骨骼肌和脂肪组织是胰岛素调节葡萄糖分布作用的主要靶器官。另外我们已经证明胰腺癌细胞还可以改变大鼠分离和灌注肝细胞的糖酵解，证据是乳酸盐产物水平下降，合并α-甘油磷酸盐代谢通路加强，其特征为1,2-DAG产物水平上升。因此我们认为代谢异常可能发生在丙糖水平，并可能涉及酶的活性和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的翻译。
虽然许多研究已经证实胰腺癌合并糖尿病的分子因素是低分子量的肿瘤细胞可溶产物，有可能是肽类，但是具体因子还未明确。这些因子作用于肝脏细胞，也可能作用于骨骼肌细胞和胰岛素分泌细胞。另外，为了明确是否存在与胰腺癌合并糖尿病相关的特征分子，我们分析了胰腺癌合并糖尿病患者和胰腺癌不合并糖尿病患者外周血中的低分子量肽谱，但是从外周血得到的结果可能与胰腺癌的产物不能准确吻合，这是因为来源于胰腺的血液首先经肝脏代谢。如果直接分析门静脉血，就能得到胰腺癌典型产物释放的直接信息，可能会解决这个问题。
胰腺癌合并糖尿病的另一个研究领域是致糖尿病产物与肝脏、骨骼肌等靶器官取得联系后的细胞内激活机制。我们认为在这个过程中NO起重要作用，理由如下：(1)有研究报道NO在骨骼肌中有胰岛素样作用；(2)胰岛素抵抗患者NO水平升高；(3)NO可干扰肝细胞的葡萄糖输出和糖原合成；(4)NO在LPS诱导高血糖症的病理生理机制中起重要作用。
因此本研究的目的是：(1)分析伴或不伴糖尿病的胰腺癌患者肝脏组织匀浆中的GAPDH酶活性和mRNA水平；(2)验证这些患者肝脏组织的NO水平是否改变；(3)用MALDI-TOF技术分析胰腺癌患者门静脉血的蛋白/肽谱型。
方 法
1. 患者 共纳入23位患者，17位为接受过手术的胰腺癌患者（男性7位，女性10位，年龄范围57岁~86岁），6位为慢性胰腺炎患者（男性5位，女性1位，年龄范围48岁~72岁），所有患者均经组织学检查确诊。在接受胰腺外科操作之前，所有患者取2份无肿瘤转移的肝脏样本，12位胰腺癌患者还取到了门静脉血样。组织样本马上冰冻，在为了作GAPDH mRNA定量或生化检测而进行RNA提取或匀化前贮存于−80°C条件下，时间不超过1月。门静脉血清以3000×g离心5分钟，在进行质谱分析前贮存于−20°C条件下，时间不超过3月。糖尿病诊断根据空腹血糖浓度高于7.0mmol/L，或根据口服糖耐量试验诊断。
2. 细胞系和细胞培养 MIA PaCa2和PANC-1（来源于人原发性胰腺腺癌）、CAPAN-1（来源于人胰腺转移癌）和正常人纤维母细胞（来源于接受隐静脉切除术者的被切除的隐静脉）在培养基中进行培养，培养基中含低糖（5.5 mM）DMEM、10％FCS、2％谷酰胺和0.1％庆大霉素。细胞（约100,00/每烧瓶）接种于含10ml DMEM的75cm2烧瓶内，培养6天后，取出培养基并以200×g离心10分钟，收集上清液（条件培养液）作质普分析备用。
3. GAPDH m-RNA定量 1份肝脏组织样本用柱层析法提取mRNA，取3mg提取的mRNA反转录入cDNA，然后用cDNA作为试剂盒的启动模板进行GAPDH mRNA定量。
4. 肝脏组织匀化 另1份肝脏组织样本用于生化检测，首先取30mg在500μl 水中匀化，其中包含胃酶解血管紧张肽、抑糜蛋白酶素等蛋白水解酶抑制剂。然后检测匀浆中的GAPDH酶活性、葡萄糖、乳酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐水平。
5. GAPDH的酶活性测定 组织匀浆在4°C条件下以35000×g离心30分钟，取40μl上清液与600μl pH值为7.6的缓冲液一起培养，缓冲液中包括82.3mM三乙醇胺、1.1mM ATP、6.2mM三磷酸甘油酯、0.9mM EDTA、0.2mM NADH和2mM硫酸镁等。每单位GAPDH酶活性用1 mmol NADH每分钟的氧化作用换算，以每分钟的Abs 340 nm变化表示（Δ/min）。
6. 硝酸盐/亚硝酸盐水平测定 肝脏的硝酸盐/亚硝酸是NO氧化的最终产物，用光度终点法测定肝组织匀浆的硝酸盐/亚硝酸盐水平，结果用Abs 540 nm表示。
7. 萄萄糖和乳酸盐水平测定 用比色法自动分析仪检测肝组织匀浆的萄萄糖和乳酸盐水平。
8. MALDI质谱分析 MALDI质谱用装备SCOUT 离子源的REFLEX飞行时间仪进行检测。离子由加速至25 kV的脉冲UV激光束产生（氮激光，λ＝337 nm）。在进行MALDI-MS分析前，非条件培养液（DMEM+10％FCS）、所有的细胞系条件培养液和血清稀释样本（1:3生理盐水稀释）须进行超滤，然后用Millipore过滤器透析2小时（孔径0.45μm）。血清样本还要用微孔过滤器过滤2小时（孔径0.45μm）。要检测低分子量肽片段须用经超滤的样本，而检测高分子量肽片段用未超滤的样本即可。5ml样本溶液与5ml基质溶液混合，取1ml混合液贮存于不锈钢容器中作质谱分析。外部质定标用质荷比（m/z）分别为5734和2867的牛胰岛素的[M+H]+和[M+H]2+离子。为了验证分析的精确性，每份样本进行3次独立分析。
9. 统计分析 统计分析采用Student’t检验、Wilcoxon检验和Fisher精密检验，小于5％为显著性检验标准。
结 果
胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者间肝脏组织乳酸盐、葡萄糖、亚硝酸盐、硝酸盐、GAPDH酶活性和GAPDH mRNA复制6个参数均无显著差异。胰腺癌伴糖尿病患者肝脏乳酸盐、葡萄糖、亚硝酸盐和GAPDH mRNA平均水平高于无糖尿病的胰腺癌患者。胰腺癌患者GAPDH mRNA复制水平与空腹血糖浓度（r=0.78，P＜0.001）、肝脏GAPDH酶活性（r=0.508，P＜0.05）和肝脏乳酸盐水平（r=0.654，P＜0.01）均存在相关性。肝脏葡萄糖水平与肝脏乳酸盐水平存在相关性（r=0.913，P＜0.001）。
非条件培养基和所有的细胞系条件培养基有20个共同片段，9个片段只存在于细胞培养基，不存在于非条件培养基，28个片段只存在于胰腺癌细胞系条件培养基。
胰腺癌患者门静脉血清中有172个片段，m/z值从1098到150078，其中某些片段存在联系。片段11748 m/z、12636 m/z和16011 m/z相互间存在正相关性（11748 m/z和12636 m/z：Fisher精密检验P＜0.05；11748 m/z和16011 m/z：Fisher精密检验P＜0.01）。片段2554 m/z和5020 m/z间存在正相关性（Fisher精密检验P＜0.01）。片段5002 m/z和3285 m/z、5020 m/z间存在负相关性（Fisher精密检验P＜0.05）。
根据是否伴糖尿病对患者进行分组，发现糖尿病和片段5002 m/z的存在以及片段2554 m/z、11748 m/z、11748 m/z、12636 m/z、16011 m/z的缺乏存在显著关联性（各项Fisher精密检验均P＜0.05）。糖尿病和片段3285 m/z（P=0.088）、5020 m/z（P=0.088）间存在负性关联，但不具统计学意义。
片段11748 m/z和16011 m/z与肝脏硝酸盐水平间都存在负相关性（Wilcoxon W=10，P＜0.05）。
结 论
与肝脏GAPDH不同，NO参与了胰腺癌合并糖尿病的过程。在门静脉血清中，是某些特殊片段/肽的缺乏而不是存在与糖尿病的发生存在关联。
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