义翘神州日前曾邀请杨嘉慧博士进行了一场题为「获得高品质重组蛋白实验方案以及经典案例分析」技术公开课，课后收到了很多专业的提问，现将相关的问答简单列举一些，希望能够帮助更多的人获得高质量的重组蛋白。

1. 是不是质粒片段越大转染效率越低?

解答：一般情况是这样的，质粒片段越大，转染效率越低，但这也与表达宿主有关，不能一概而论。所以有时在进行表达载体优化时，会将质粒的片段或非重要功能区的一些片段进行删减，可以获得较好的转染效率。

2.HEK293 瞬转表达重组蛋白相对于 CHO，哪个更有优势？

解答：这个问题比较宽泛，也没有标准的答案，我们只能结合目前的一些经验说一下。我们义翘神州经过十多年的重组蛋白表达，在细胞、载体及培养基等整体表达体系都进行了优化。经过优化的体系，HEK293 瞬转表达重组蛋白体系的细胞密度要高于 CHO 细胞，所以在蛋白表达量方面，HEK293 瞬转表达的重组蛋白要比 CHO 更好一些。但在蛋白的修饰和活性方面，我们目前还没有发现明显的差异。

3. 用合成的 300bp 片段基因，蛋白怎么都表达不出来怎么办？

解答：首先需要确定，这段合成的基因片段有没有经过密码子优化？是不是要在大肠杆菌中表达蛋白呢？如果已经做过密码子优化，也是要在大肠杆菌中表达，并且确定该蛋白不会对细胞有毒性，那我们可以尝试在 N 端加标签，或者更换启动子、菌株。然后也可以对大肠杆菌的培养条件以及诱导条件的参数（如温度、时间）进行优化。如果是毒性蛋白，则建议尝试获得包涵体的条件。如果使用真核细胞表达蛋白，由于表达体系比较复杂，需要结合具体的表达系统具体分析。也可以跟义翘神州的技术支持人员进行详细的沟通。

4. 用 293F 表达时常遇到蛋白无法分泌，有好的尝试方法吗？信号肽、培养基、培养添加物?

解答：这个情况我们也会经常遇到，我们一般会首选使用蛋白自身的信号肽进行蛋白的表达。在自身信号肽无法分泌的时候，我们尽量会尝试用一些高分泌的信号肽添加在这个蛋白的 N 端，然后进行蛋白分泌。另外可以考虑的一种情况，如果你发现目的蛋白在胞内有一定量的表达，只是没有分泌出来的话，很可能跟目的蛋白的修饰和折叠有一定的关系。我们一般会考虑，尽量将温度降低，让它的表达或者细胞增值的速度尽量缓慢，给蛋白的后修饰提供更多的时间，让它进行完整的修饰，从而对蛋白的结构和折叠有一个促进作用，可以尝试这样的方法是否有效。

5.GST 标签是不是很容易遮盖住目的蛋白的抗原表位？

解答：GST 标签分子量大约 26KD，属于大分子量标签，相对于 his、flag 等小标签来说 GST 对蛋白的影响较大。尤其是目的蛋白分子量较小时，我们应该尽量避免使用 GST 标签。此外，可以添加一段 linker 在标签和目的蛋白之间，避免标签遮盖住目的蛋白的抗原表位。

6. 请问对于还原性的蛋白在表达纯化过程中有什么建议能尽量保证活性吗？特别担心因为纯化操作把活性破坏了。

解答：在纯化过程中，一、尽量避免氧化条件的出现，例如缓冲液脱气甚至充氮气，避免引入高价金属离子（具有氧化性）；二、可以加入低剂量的还原剂来维持蛋白的还原环境，或者是氧化还原对。

7. 采用 pET22b 分泌表达载体，但总在细胞质中表达，有分泌表达的建议吗？

解答：有可能是折叠不完善，可以先尝试降温等降低表达的速度方式，让蛋白尽量完成折叠。如果该载体分泌效果不好，还可以考虑换信号肽，比如 pelB 换成 OmpA。

8. 常用 Fc 标签融合表达时会遇到目的蛋白下方出现 Fc 蛋白，有办法避免吗？

解答：首先需要确定 Fc 标签和目的蛋白之间有没有其他序列。如果两者之间没有其他序列，建议先从降温和缩短表达时间等防降解的通用方法上考虑优化，当然这种情况是确定降解发生在表达阶段。如果两者之间有其他的序列，也可以考虑改造这段序列上入手。

总之，「后浪」的小师弟、小师妹们提出各种各样的问题，核心目的就是解决重组蛋白表达过程中出现的各种异常，希望能够用更好的方式解决问题，获得高质量的重组蛋白。