一、实验目的

1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；

2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。

二、实验原理

有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。

这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。

用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。

进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式：

计算：

V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；

V 0 －原溶液的体积；

S 1 －原溶液中有机溶剂的浓度

S 2 －要求达到的有机溶剂浓度；

100－指加入的有机溶剂浓度为100％。如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式(100一S2)项应改为(95一S2)。

在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交叉方法求出。

本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。

根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。

用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：

(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。溶剂应预冷，加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。

(2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等电点附近，以提高被分离物质的分离效果。蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高浓度样品的共沉淀作用。

(3)溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。

(4)有机溶剂中有中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离效果。中性盐浓度一般0.05mo1/L 左右为好，过高影响沉淀。