PCR技术大攻略_实验方法

一、PCR技术及步骤

聚合酶链式反应（PCR）
PCR扩增产物的克隆

上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。

二、PCR常见问题汇总

1. 没有得到扩增产物

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。

（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）使用PCR试剂盒时还应注意：

①是否严格按照说明书操作；

②试剂使用前是否充分混匀；

③试剂储存过久或不当而失效。

2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

（5）退火温度过低。

（6）电泳体系有问题：

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

②凝胶没有凝固好；

③琼脂糖质量差。

（7）若为PCR试剂盒则可能：

①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

3. 溴酚蓝前有区带（很宽）

（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。

（2）循环次数太多。减少循环次数。

（3）复性度偏低。提高复性温度。

（4）预变性后没有立刻上机循环。

（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。

（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。

4. 扩增产物出现多条带

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。

（5）样品处理不当。

（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。

（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

5. PCR假阳性结果

（1）引物设计不当，应调换引物。

（2）循环参数不合适，导致非特异性扩增。

（3）靶序列的交叉污染。

6. PCR假阴性结果

（1）引物长度不够。

（2）试剂浓度不标准。

（3）靶序列如突变、缺失等。

（4）循环参数设置错误。

（5）标本中有Taq酶抑制剂。

（6）PCR产物检测系统灵敏度不够。

三、PCR经验总结

1. 增加PCR的特异性

（1）引物设计

这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件：

a 足够长，18-24 bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量；

b GC% 40%~~~~60%；

c 5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性；

d 避免3'端GC 富集，最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC；

e 避免3'端的互补，否则容易造成二聚体。

f 避免3'端的错配；

g 避免内部形成二级结构；

h 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端,，在算Tm值时不需要加上这些序列，但在检测互补和二级结构是要加上它们；

i 需要使用兼并引物时，要参考密码子使用表,注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1 uM-3 uM)；

j 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.

* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55 ℃到70 ℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5 ℃。

设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5 ℃，以2 ℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5 ℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5 ℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

（2）引物的稳定性

定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100 μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20 ℃。以大于10 μM浓度溶于TE的引物在 -20 ℃可以稳定保存6个月，但在室温（15 ℃到30 ℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20 ℃保存至少1年，在室温（15 ℃到30 ℃）最多可以保存2个月。

（3）优化试剂浓度

a. 镁离子

Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5 mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5 mM带有荧光探针的镁离子溶液。

b. 其他的离子

NH⁴⁺ K⁺都会影响PCR。增加K⁺的浓度后，会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了PCR的严谨性(stringency)。NH⁴⁺也有相同的作用.。MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER，一种是加Mg的一种是已经混合了(NH₄)₂SO₄的。当然，过高的阳离子浓度(KCL>0.2 M)时，DNA在94度根本不会发生变性，当然也就无从谈起PCR了。

c. 聚合酶

不同公司的酶效有所不同，需要实验者自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase，所以可能需要的酶的量也要大一些。另外，一般的情况下，变性的温度可以使用90~92度，变性的时间也可以缩短，从而保证聚合酶的活性。

d. 模板

50ul PCR SYSTEM

human gDNA 0.1 ug-1 ug

E.Coli 10 ng-100 ng

LamadaDNA 0.5 ng-5 ng

Plasmid DNA 0.1 ng-10 ng

（4）温度

a. 变性

常规是94度5分钟，GC 富集的摸板是95度5分钟，除了GC富集外，常规的操作可以将这部分时间缩短到1到2分钟，或者在循环1时给予较长的时间，而取消开始的变性。

b. 退火

重点到了。一般情况下，是从55度开始，根据情况配合以Mg离子浓度进行调整。有条件的可以做梯度pcr。退火的时间在30-60 S，时间短一些可以得到更好的效果。因为聚合酶在退火温度时时也会有一些活性。所以在A.T.的时间过长，会极大的增加非特异性扩增的风险。另外，在对于一些困难户，比如从gDNA里扩增大片段，还可使用二步PCR。

（5）touchdown PCR

原理很简单，但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK，退火温度55度

94 5 min

94 30 s

60 30 s

72 1 min 2cycles

94 30 s

59 30 s

72 1 min 2cycles

94 30 s

58 30 s

72 1 min 2cycles

........

94 30 s

51 30 s

72 1 min 2cycles

94 30 s

50 30 s

72 1 min 20cycles

72 5 min

（6）热启动 PCR

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，暂停，将温度保持在70度以上，手工加入聚合酶，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。

ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)

Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)

Magnesium wax beads (Stratagene)

象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用灭活的DNA聚合酶，聚合酶被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样聚合酶又被激活了。

（7）booster PCR

我们知道1 ug 人基因 DNA 大约在3X10⁵幂个模板分子，这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合。当模板的浓度过低，比如低于100个分子时，引物和模板之间就很难发生反应，引物容易自身进行反应形成二聚体，这样就有来了个 booster PCR，我一直找不到合适的词来翻译这个booster，具体是这样的：开始几个循环保持引物的低浓度，保证引物、模板的摩尔比在10⁷~ 10^8_，以确保开始扩增的准确性，然后booste Primer的浓度到正常的水平。

（8）循环数和长度

确定循环数的基本原理是：产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数，因为过多的循环数容易造成错配和非特异性产物的积累产物的量不够，优化的方法有：

a 增加模板

b 增加循环数

如何确定循环数，有一个方法：做一个PCR体系，40循环，50 ul，分别在20，25，30，35循环时从体系中取5 ul，一起跑电泳分析，从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR 循环时在两个温度间变化的速率，当然是越高越好，不过咱们大部分条件有限，就那么几台PCR仪，也没有多少挑选的余地。

（9）热循环

PCR仪的因素我们经常容易忽视，长时间的使用后需要调整PCR仪，以保证其能够到达正确的温度。现在的PCR仪基本上都有自检功能。

（10） PCR 附加物

附加物或者说增强剂实在是多种多样，基本上包括几类，能够增加反应退火效率的化学因子，DNA结合蛋白和一些商业试剂。基本的原理不外是增加引物退火特异性，减少错配，增加产物的长度和产量。在GC 富集情况中，添加剂可以造成配对碱基间的的不稳定，从而提高扩增的效率，而在另一种情况下，添加剂由于造成错配的引物模板复合物的极大的不稳定，而提高了扩增的忠实性。要注意的是，没有万能的增强剂全部通用，需要你根据自己的情况，最好结合梯度 pcr选择最优条件。

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dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%

formamide at 5%

trimethylammonium chloride 10-100 uM

detergents such as Tween 20 0.1-2.5%

polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%

glycerol 10-15%

single stranded DNA binding proteins

Gene 32 protein 1 nM

E.coli single-stranded DNA binding protein 5 uM

7 deaza-dGTP(for GC rich) 150 uM with 50 uM dGTP

Taq Extehder (stratagene)