各位大侠，小妹要对HCE细胞的Toll样4受体做检测，但是细胞自身表达量太低，正常细胞提取RNA之后做逆转录都没有结果，而且我还要对其表达进行干扰，转染shRNA进去，结果就是做pcr时更没有结果了（内参很好），PCR反应条件如下：

20ul volum

cDNA loading 3ul

10xtaq buffer 2ul

dNTPs(2.5/each) 2ul

Mg2+ 1.5ul

primer(F+R) 0.2ul

Taq 0.2ul

ddH2O 11.1ul

94℃ 3min

94℃ 45s

56℃ 45s 38cycles

72℃ 1min

72℃ 10min,4℃ hold forever

PS：做逆转录时mRNA为2ug

PCR结果是用1.5%凝胶电泳检测，除了内参GAPDH，没有目的条带。都已经做了好多次，模板量由原来的1ul 增到3ul，还是没结果。之前做的该蛋白的overexpress表达体系有条带P出来，但是正常的对照都是没有的。现在要做干扰，要怎么做PCR才能检测到呢。

有哪位PCR高手给指点下啊，这么久没结果，老板要发飙了

一些PCR过程中的技术问题就不多做猜测了。
如果PCR引物没设计好，或者RNA没提好，或者PCR条件不对，自己解决去。因为你也没贴出来，站友们无法为你答疑。这里单从实验意义上进行分析：
印象中TLR4是机体对细菌的特异性识别受体，主要是LPS，脂多糖，鞭毛之类的应答。如果你没有做什么处理，那正常细胞的TLR4的表达量就应该很低的，建议用real time PCR来做，如果真的很低么，也没办法，就是P不出来了。
建议拿一个TLR4阳性样品做阳性对照，确认你的引物和体系没问题。

我的引物是没问题的，而且在过表达的细胞中提出RNA后再做PCR时工作的很好。RNA使用试剂盒提的，纯度也还可以。按照这个PCR条件以前做出过来一次，以后就再没做出来过。模板量及退火温度等相关因素能调的我都试过了，可是就是没结果。正常细胞中的TLR4表达量是不高，但是之前做出来过，现在重复不出来，而且以前做的瞬转质粒knock downTLR4表达细胞中，WB检测也出国结果。问题是现在这些都做不出来了。
如果用realtime PCR要怎么做呢，我之前没做过，能否指教一下？

拿一个TLR4的已知序列，比如以前P出来的PCR产物，10倍稀释梯度，去做标准曲线，以及做为阳性对照。
如果每个梯度之间的Ct值差正好是3.326, 扩增效率100%左右，那你的正常细胞的Ct值，是多少，就从这条曲线上去对。如果超过35了，说明真的很少，不用担心，不是你实验的问题。
但如果你的标准曲线都做不好，或者引物效率很差，那说明是你的体系出问题，或者是引物不行，或者是条件摸索的不好。

，谢谢bell