设计策略

PS：该方法适用于检测或部分 DNA 片段克隆，不适合全长基因克隆

反转录 PCR 的主要问题是基因组 DNA (gDNA) 污染的存在，这将导致产生假阳性信号，特异性降低或对特定 RNA 的过高估计。为了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干扰，可将引物设计为与两个外显子的接合部退火，该点为 cDNA 序列专有，因此 gDNA 将不能被扩增。

cDNA 特异的引物可通过三个途径设计（如下图所示）。

cDNA、gDNA选择性引物设计原理图

1. 引物横跨外显子-外显子接合部。设计的引物如果一半与一个外显子的 3'端结合，而 另一半与相邻外显子的 5'端结合，它将只与 mRNA 或由已剪切的 mRNA 合成的 cDNA 退 火，而不与 gDNA 结合，因而可以避免对 gDNA 污染的扩增。正向或反向引物都可设计为 横跨外显子接合部；而另一个引物可设计为结合于另一个外显子接合部或在完全位于外显子 内部的位点上。

2. 外显子完全配对-内含子交叉配对引物。为了从 cDNA 和 gDNA 混合物中选择性地扩增 gDNA, 设计的引物应与外显子-内含子接合部退火，这种引物叫做外显子完全配对-内含子交叉配对（exon-primed intron-crossing，EPIC) 引物（Bierneetal. 2000)。EPIC 引物可 在系统发育研究中用于扩增同源的内含子区域，因为外显子序列相对内含子而言更保守。

3. 引物位于外显子-外显子接合部的侧面。设计的 RT-PCR 引物位于至少含一个内含子 的区域的侧面。这样以 cDNA 为模板扩增的片段要小于以 gDNA 为模板扩增的片段，这种 大小的差异可以帮助检测 gDNA 污染的存在。

相关试验方法的下载，请到生物学霸公众号，回复：PCR引物设计

实验方法名称：

A Global single-Cell cDNA Amplification Method for Quantitative Microarray Analysis

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