实验方法

【求助】【求助】有PCR的高手请教一个片子

2015-09-01 17:48



这个是我今天跑的很失败的普通PCR结果。

我是一个新手,所以···实在很失败

cDNA做的PCR,反应体系是塔克拉的,那种非预混的酶体系

胶是2%的

可是结果,这些条带很奇怪···求教高手···万分感谢!
电泳液换新的。胶浓度不要那么高。0.8-1%即可!
是不是电压的问题
应该是电压的问题,电压或者电流太高了把,我也出现过类似情况,跑慢点就好了!
缓冲液的问题
仔细看了一下这个图,MARKER跑的挺正常的,应该与电压、缓冲液、胶浓度等电泳中的参数关系不大。不过MARKER没怎么跑开却是个问题。目的条带出现这样的问题,应该是PCR过程中产生的。可能这些条带并非是你引物特异性扩出的目的条带。如果PCR非常成功的化,目的条带会很亮且跑电泳时一般不会出现这样的怪带。建议优化PCR反应条件,如改善退火温度、新换反体体系、换台PCR仪等试试看。
调整一下加模板的量,可以在PCR体系中加入DESO
首先你看一下你要扩增的目的条带多大,上面那条带是不是你要的目的带,如果是,你只需提高一下温度消除下面的引物二聚体即可;如果不是,那温度你要继续摸索一下,再不行就换引物了。这个Marker没跑开,胶需要再跑一会或者胶做稀一点;样品条带弯曲不是一条线,可能是样没点好,孔中有气泡,样不是均匀分布的
可能是胶的浓度太高了,还有胶放在TBE中太久了,也会出现这种效果
大侠们啦,绝对不存在胶浓度2%太高的问题,我们要用电泳分型差异在20bp左右条带时得用4%的呢,只要煮透就好用。不知楼主这胶是现配先用的吗?胶孔暴难看嘛。PCR产物的问题,鉴定完毕!
应该是胶没有煮透,琼脂糖没有完全溶解,导致胶的浓度不均一。
你的胶是不是回收后反复用的啊,要现用现配,回收后反复使用一两次可以,多了就会出现这种情况,另外电泳液也该换了。
现配先用的胶,不该是胶的问题,因为marka很直,我觉得应该可能是PCR的时候出问题了,不过后来就没有这样的图了,还是谢谢各位高手的指导!

本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

师兄微信号:shixiongcoming

扫码关注「实验菌」,入科研社群,领学习资源

更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!

查看全部

来源:丁香园论坛

扫码关注「实验菌」,入科研社群,领学习资源

更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!

知道了