PCR反应程序的优化

1二价阳离子。

在使用没有加Mg2+反应液时，应注意一定要外加一定浓度的镁离子。大量.二价镁离子与dNTP和模板〔磷酸二酯键骨架上的负电荷)结合，从而大大提高了反应的效率和特异性。

2引物。

PCR所需的引物终浓度一般为0.1~1.0µmol/L，使用更高浓度的引物将使所得的产物量急剧减少。如果新合成的引物在退火温度接近Tm值的情况下没有产物生成，就降低退火温度再进行反应;如果这样仍旧不能反应，则应马上放弃这对引物，重新选择引物序列。

引物合成的定购没有量的限制，合成的引物是以冻干的状态运输的。第一次使用时，要加人灭菌水或TE溶液(10mmol/L Tis, pH8.0；0.1mmol/L EDTA)进行溶解。

然后，通过紫外吸收值确定各个引物的浓度。千万不要相信管子上或产品报告单上所列的引物量是准确的。通过实验准确确定引物的浓度是进行对称性PCR的关键。使用非等量的上游引物和下游引物将导致错误产物的合成。常用的引物纯化方法有:脱盐，柱纯化，反相高压液相色谱（HPLC），聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)及凝胶过滤。

a 脱盐的费用通常包括在引物合成的费用中。脱盐的目的是除去残留的化学物质或有机物。它们来自引物合成的过程中，如脱离合成柱、去除保护基团等二对于小于肠个碱基的引物，脱盐处理就可以满足PCR的要求。对于大于35个碱基的引物，或者对引物的纯度有更高要求时，就需要进一步的纯化。

b 柱纯化是一种快速的方法，其所得的引物纯度与HPLC纯化的相近。这种方法的原理是全长引物在5’末端有DMT基团(二甲氧三苯甲基)，而末端短缺的引物分子没有这一基团，因此它们之间的疏水性不同。柱纯化适用于大于50个碱基的引物的纯化。用柱纯化或HPLC:纯化的引物，可以提高定量分析、克隆及位点特异性突变反应的效率。

c 通过反相HPLC.纯化的引物纯度通常可以超过95%。纯化的原理与柱纯化的相同。HPLC可以用于纯化大量(如大于1µmol)的引物，但是不适用于大于50个碱基的引物。

d PAGE纯化是终极的纯化方法。使用这种方法纯化的引物纯度一般可以达到99%,由于聚丙烯酞胺凝胶可以区分无论是长度还是序列的单一碱基差异的分子，长度在50-100个碱基之间的引物均可以使用这种方法进行纯化。因为要从凝胶中回收引物，所以Page纯化得到的引物量比较少.

e 凝胶过滤的方法，由于去除了合成引物及纯化过程中存在的痕量化学物质，消除了可能的细胞毒性。当寡核苷酸计划用于与细胞有关的体内实验或反义检测等实验时，强.力推荐这种纯化方法。

这一方法可以单独使用也可以结合以上几种方法共同使用。单独使用时。凝胶过滤可以除去引物中的无机盐类、反应残余的化学物质和极短的末端缺失序列，之后就可以将引物冻干，重新溶解在适合的缓冲液中并定量.

3 反应组分。用旧的模板和新的PCR试剂盒前，应该测试一下其中的组分。许多PCR试剂盒都含有供测试的模板和引物。可用来验证反应体系是否有作用。存在问题的反应组分与引物设计有误及降解的模板一样，都可能使反应不能产生产物。

此外，以下几种物质都可以抑制PCR的进行;苯酚、氯仿、硫氰酸胍、十二烷基硫酸钠(SDS)，N-十二烷基肌氨酸钠、腐殖酸、乙醇、溴酚蓝、EDTA及矿物油。