miRNA实时荧光定量PCR

• 实时荧光定量PCR

从1996年美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：

（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光基团与淬灭基团分离，发出可被检测到的荧光，以此来监测整个PCR过程。

（2）SYBR荧光染料法：该方法利用了SYBR Green荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性，检测PCR的全部进程，从而判定初始RNA的量。

• 常用的miRNA第一链合成方法

成熟的miRNA大小只有22nt左右，在用实时荧光定量PCR检测miRNA时，难点在于如何识别如此小的miRNA并合成第一链。目前常用的用于识别并合成miRNA第一链的方法主要有颈环法和加尾法两种。

（1）颈环法原理图

（2）加尾法原理图

由于成熟miRNA较小，无法用常规的方法直接进行反转录、PCR。所以上述两种方法分别加PolyA尾及颈环结构的方法，将miRNA配对的序列延长，然后进行正常的反转录及后续的PCR检测。颈环法只针对成熟miRNA，特异性相对较高，但操作繁琐，成本较高；加尾法可以检测到成熟miRNA及pre-miRNA，特异性稍低，但操作及引物设计简单。

• 分段探针捕获miRNA

近年来，研究人员发现了越来越多的miRNA，其中有很多miRNA序列相近，有的仅仅只有一个碱基差异。这些不同的miRNA虽然序列相近，但是也有着不同的来源及功能。上述两种方法虽然解决了miRNA的识别及后续PCR问题，但是无法分辨这些只有一个或者两个碱基差异的miRNA。

美国Signosis推出的新方法，使用多对寡核苷酸对目的miRNA进行识别，单个碱基差异就可以破坏寡核苷酸与靶标序列的结合，从而分辨单个碱基差异的miRNA；同时该方法不用进行方转录，避免了反转录过程中出现错配的可能；同时，这个新方法还引入了磁珠分离技术，在进行PCR前，通过结合有链霉亲和素的磁珠对特异性标记有生物素的靶标序列进行纯化，大大提高了特异性。