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| 定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量 | DNA模板质量不好，含有抑制剂 | 提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA |
| PCR引物设计较差 | 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 | |
| 探针设计较差 | 对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针 | |
| PCR引物合成较差 | 用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。 | |
| 荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 必要的话设计和合成探针。 |
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| 模板浓度太低 | 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 | |
| 镁离子浓度太低 | 从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。 | |
| 引物浓度太低 | 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1) | |
| 选择优质酶进行扩增 | 选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素 | |
| 退火温度太高 | 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 | |
| 反应物中有不明物干扰 | 在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。 | |
| 定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对：已经优化好的体系) | 引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认： | 反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； 正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； 确认体系：1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能；2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强)。 |
| 仪器是否正常工作 | ||
| 定量PCR阴性对照一直有扩增曲线 | 模板或PCR残余污染 | 隔离污染来源，更换试剂。 使用UNG/dUTP防污染系统。 使用专用的精致移液器。 在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。 |
| 体系有问题 | 酶浓度不对，Mg离子浓度不对 | |
| 定量PCR(染料法)出现非特异信号 | 引物二聚体多 | 检查引物设计和合成环节，必要时更改引物 |
| 更换热启动酶 | 热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度 | |
| 设定检测信号时的温度 | 在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链) | |
| 定量RT-PCR 无扩增产量 相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照 |
无cDNA合成 | |
| cDNA合成温度太高 | 降低保温温度 | |
| 反转录cDNA产物被二级结构封闭 | 提高保温温度。重新设计引物 | |
| RNA被损害或降解 | 必要的话更换RNA | |
| RNAse污染 | 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 | |
| 荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 必要的话设计和合成探针。 |
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| 灵敏度低 须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后) |
初始模板RNA不充分 | 增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA |
| RNA被损害和降解 | 必要的话更换RNA | |
| RNAse污染 | 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 | |
| 无效的cDNA | 通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂 | |
| 无效的PCR扩增 | 注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 调整cDNA合成温度或引物设计 |
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| 检测使用仪器 | 扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后 | |
| PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误 | 采用荧光探针法 | 增加结果特异性和产物的忠实性 |
| 循环数太多 | 降低循环数。 | |
| 四种dNTP的浓度不同 | 制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 |
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