RT-PCR原理与实验技术_实验方法

一、知识背景：

1. 基因表达：DNA——RNA——Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因——104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）——共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

2. PCR技术(Polymerase chain reaction)：

即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；

B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ —— 3’方向延伸。

以上三步为一个循环，如此反复。

3. 逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；

(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；

(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.

二、RT-PCR的准备：

1. 引物的设计及其原则：

(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:

a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。

d.引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。

e.引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。

f.同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。

g.5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。

根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。

2. 耗材：

实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。

3. 试剂准备：

变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。

三、RNA的提取方法：

RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。

因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。

RT－PCR步骤：

1、RNA的提取：

2、cDNA的合成：

逆转录体系的组成：

3、PCR扩增：

50ul PCR体系的组成：

4、PCR反应条件：

四、PCR条件的优化：

PCR条件的优化主要是

①引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。

②此外Mg2＋浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2 mM左右。

③引物和模板的量等。

五、产物的电泳和结果的测定：

根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度），取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。

分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度

六、需注意的问题：

1. 注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭（EB）、酚、异硫氰酸胍、紫外线等。

2. 注意避免试剂污染。

3. 始终注意避免RNA酶的污染。

4. 保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实验室卫生。

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