条带有两条。一条为目的条带，479bp，另一条不知道是不是非特异性条带，241bp，两种条带都很清晰，如图所示:前三个泳道是样品，后三个泳道为内参。循环条件：94℃5 min；94℃30 S，60℃30 s，72℃30S，34个循环；72℃5 min。退火温度提高至62℃，仍然为两条条带，不知道是条件的问题还是引物特异性的问题，请教各位高手帮我解答。

如果普通PCR定量，可以不用管它，但从位置看是不是污染了内参的引物

有两条带，首先引物的问题比较大。设计引物的时候是否是按照跨内含子进行设计的，这样设计的引物一般不会从基因组中P出条带。再就是提取RNA的时候保证纯度，不要有基因组污染。引物温度的问题可以通过做一个梯度温度PCR进行解决，筛选出最佳的温度。如果是前两个问题，那么引物需要重新设计，再就是提取RNA时需要小心一些。

我之前也在做RT，你的情况可能是模板的问题，就是提的RNA有DNA污染，所以，如果你的引物是跨内含子设的（这是正确的设计方法），那么自然就会有一大一小两条带：还有可能是如楼上所说，你的引物设计的特异性不高或则没有找到最佳退火温度而导致的非特异扩增。建议你先做梯度，如果一直都有两条带，那么检查一下引物的位置，若是跨内含子的，基本上是模板不纯，只能重新提RNA了。

谢谢各位！受益匪浅。