1.区分生物学重复与技术重复

生物学重复：指样本重复，比如3只小鼠，同时做一种处理，就是三个生物学重复。

技术重复：一般是三次实验，比如对一块组织，提了三次RNA，做三次real time。

2.设置生物学重复的意义

由于新一代测序技术的优越性以及高成本，曾一度忽略了“生物学重复”的重要性。但生物学重复对于测序实验的设计以及实验数据的解读和分析都非常重要。

设置生物学重复：

能够消除组内误差：生物学重复可以测量变异程度

增强结果的可靠性：测序的样本数越多，越能够降低背景差异

检测离群样本：异常样本的存在，会严重影响测序结果的准确性，通过计算样本间的相关性可以发现异常样本，将其排除。

案例一：

注：COX4NB和RASGRP1基因在生物学重复样本中表达值的散点图：

左边红色，COX4NB基因表达值的散点图

右边蓝色，RASGRP1基因达值的散点图

上面一行，测序数据的散点图

下面一行：芯片数据的散点图

COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。结果意味着：不同实验组间 COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。

由此可知，设计的实验如果没有生物学重复，或者生物学重复的数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果；获得的差异表达的基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映疾病或者某种特定生理状态的群体本质特征。

3.生物学重复设置几个合适？

您是不是有同样的问题：转录组测序是否必须进行生物学重复啊，是否要3个重复，是否可以用3个样品的RNA等量混合代替生物学重复，如果不重复能否发文章…..？一方面是有限的经费，一方面是编辑的质疑；实在很难抉择呀~~~

目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复。文章投出之后，遭编辑质疑。那就得结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验，FISH荧光原位杂交，或者是northern 杂交等，用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，然而考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。

注：3个生物学重复，不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序，相当于将3个样本的基因表达量取了平均值，其实就是相当于取了一个样本，由此得到的差异基因同样不可信，不能反应群体生物学现象。

4.生物学重复分析结果展示

以公司做项目的经验来看，原核生物以及真菌生物学重复的效果>植物>动物，这是由于动植物个体差异较大所导致。所以动植物在选取生物学重复时，应按照严格的筛选条件进行取样，方可得到理想结果。

案例二：真菌的转录组测序

实验设计：处理组与对照组（n=3)

实验结果：如下图所示，重复样本间的相关系数r>0.9

案例三：植物转录组测序

实验设计：处理组与对照组（n=3)

实验结果：分析发现有一组样品明显偏离其余两组样品，确定是样品问题后，将其去除，得到两重复样本间的相关系数r>0.95

5.生物学重复取样要求：

不是任意选取几组样品都能做为生物学重复样本，尤其是动植物个体，由于个体差异大， 在选取生物学重复样本时，应严格控制变量。

植物取样：同一片试验田，同一长势，外部形态特征相同

动物取样：同一遗传背景，同一饲养条件，同一年龄，性别相同，外部形态特征相同

混合取样：保证混合样品处理方式相同，处于同一发育阶段，个体外部形态特征相同

参考文献：
1. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Kasper D Hansen,Zhijin Wu, Rafael A Irizarry & Jeffrey T Leek. Nat Biotechnol., 2011. 29(7):572–573.
2. The Power of Replicates-Illumina
3. Statistical Design and Analysis of RNA Sequencing Data.Paul L.Auer and R.W. Doerge. Genetics.