第一部分 Total RNA 的提取

一、 试剂配制

准备工作：

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：

▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5

三水合柠檬酸纳 22.94g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：

肌氨酸钠 10g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：

0.78M柠檬酸钠 8.25ml

10%肌氨酸钠 12.375ml

异硫氰酸胍 118.05g

加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用

临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

▲2M 醋酸钠 PH=4.5

NaAc・3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲3M醋酸钠PH=5

NaAc・3H2 O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用

▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用

▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC・3H2O 4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

▲1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml，用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高压过） 200UL

溴酚兰 10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨 310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3个月

▲10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至1000ml

▲变性电泳胶：

称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液：

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml

二、 动物组织 total RNA 的提取

1.根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。

2.将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。

3.根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。

4.根据表1加入适量酚/氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

5.冰浴10分钟。

6.4°C，12000g离心20分钟。

7.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8.加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。

9.4°C，12000g离心20分钟。

10.   根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11.   加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

12.   4°C，12000g离心20分钟。

13.   小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。

14.   4°C，12000g离心20分钟。

15.   弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。

16.   弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17.   取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。

表 1

Mg# of tissue	500	800	1000
变性裂解液(ml)	5	8	10
2M NaOAC pH 4 (ml)	0.5	0.8	1
水饱和酚 (mL)	5	8	10
氯仿 (mL)	1	1.6	2
异丙醇(mL)	4	6	8
变性裂解液 (mL)	0.5	0.8	1
异丙醇(mL)	0.5	0.8	1
75% 乙醇(mL)	1	1	1
DEPC-treated H2 0 (mL)	0.5	0.8	1

三、植物组织total RNA的提取

1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。

3. 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。

5. 冰浴10min。4℃，12000g离心10min

6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。

7. 4℃，12000g离心20min。

8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。

9. 4℃，13000rpm离心15min。

10.  用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

11.  4℃，13000rpm离心10min。

12.  取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。

13.  4℃，13000rpm离心15min。

14.  弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。

15.  弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。

16.  用40－60μl DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17.  取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

四、 TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1.查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2.将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。

3.室温温育10分钟。

4. 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。

5. 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。

6. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。

7.  4ºC，12000g离心10分钟。

8. 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9. 4ºC，7500g离心5分钟。

10．去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER，溶解沉淀。

11．取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。

表2

组织量	TRIzol Reagent	氯仿	异丙醇	75%乙醇
50~100mg	1ml	0.2ml	1ml	1ml

第二部分 mRNA 的分离

一、Oligotex mRNA Kits  (QIAGEN）法

 准备工作：

1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.，然后置于室温。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。

试验步骤：

表3：加入试剂量据此表

Total RNA	RNase-free Water to:	Buffer OBB (μl)	Oligotex Suspension  (μl)	Prep size
<=0.25mg	250μl	250μl	15	Mini
0.25-0.5mg	500μl	500μl	30	Midi
0.5-0.75mg	500μl	500μl	45	Midi
0.75-1.00mg	500μl	500μl	55	Midi

1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500μl

2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀

3. 置于70℃水浴中3min

4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min

5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。

6. 用移液器取400μl OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min

7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400μl OW2，RT，  13000rpm，离心1min

8. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中，取出25μlOER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

9. 取出25μl OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

10.  测OD，并电泳定量。

二、磁珠法分离 mRNA

1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul。

2.  65ºC加热10分钟。

3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。

4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml。

5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA―PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

9.    用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.

10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。

11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。

13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。

14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀过夜。

15.4ºC，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。

16.4ºC，7500g离心10 分钟。

17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。

18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。

注意事项：

1.所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行

2.如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。

3.mRNA的电泳图是smear。

第三部分 cDNA 双链合成

一、 Superscipt II―RT 合成第一链 :

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中，加入

xμl   mRNA(大约500ng)

1μl   Xho I Primer(1.4ug/μl)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG TTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x μl   RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链， 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）

2. 混匀后，70℃反应10分钟;

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5min;

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂:

4μl  5×first strand buffer

2μl   0.1M DTT

1μl  10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟;

6. 反应完成，趁热加入1 μl Superscipt II―RT，混匀;

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶.

二、 cDNA 第二链的合成 :

1. 第一链反应完成后，取2μl一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):

20μl   10×DNA Polymerase I buffer

6μl    10mM dNTP(自己配制)

xμl    dd H₂O

1μl    RNase H(2U/μl)

10μl   DNA Polymerase I(10U/μl)

总体系为200μl;

2. 混匀后，16℃反应2.5小时;

3. 70℃灭活10分钟;

4. 反应完成后，得到200μl cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上;

5．取2μl二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。

三、双链 cDNA 末端补平 :

1. 在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂(promega):

6μl   10mM dNTP

2μl   T4 DNA Polymerase(8.7U/μl)

2μl   BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物， 37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后，吸取上清于另一1.5ml eppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日，将昨日沉淀物在4℃，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕，弃上清，加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味.

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程：

1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。

2．向200μl二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3．加入spin column中，13000rpm离心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。

5．13000rpm，再离心1min。

6．将spin column放入一新的离心管中，加入50μl buffer EB，静置10min。

7．13000rpm离心2min。

8．加入30μl buffer EB，静置10min。

9．13000rpm离心2min。

10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

四、 EcoR I adaptor 加接 :

1. 往双链cDNA沉淀中加入9μl EcoR I adaptor(400ng/μl)，4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后，顺序加入下列试剂:

1.2μl   10×Ligase Buffer

1μl    10mM rATP

1μl    T4 DNA Ligase(4U/μl)

3. 混匀后，4℃连接3days，或者8℃过夜连接;

五、双链 cDNA 末端的磷酸化及 Xho I 酶切 :

1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA  Ligase;

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1μl   10×Ligase Buffer

1μl   10mM rATP

6μl   dd H₂O

1μl   T4 PNK(10U/μl)

3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4. 稍微离心使反应物集中至管底;

5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4μl   Xho 10×Buffer

2μl   BSA

5μl   ddH₂O

8μl    Xho I (10U/μl)

6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

六、 胶回收 cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒 )

1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2μl EB/300ml 胶

2．取4℃保存样品上样，40μl/孔。

3．电泳50V；1hr

4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300μl buffer QXI）

6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5μl QIAEXII

7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）

9．加入500μl buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬

10．离心并去上清（同操作8）

11．加入500μl buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清

12．再加入500μl buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清

13．超净台上吹干（至无乙醇味），加入10μl elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14．取1μl上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。

15．将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

注意事项：

1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1％的HCl浸泡过夜。

2．胶回收时电压要稳定。

第四部分 载体制备

一、pBlueScriptII 的提取

1.取1μl商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5μl转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。

2.第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。

3.第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。

4.将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）

5.加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8.0），加入RNase至终浓度100µg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。

6.按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。

注： 静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。

8.4℃，5000rpm，离心15min。

9.取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。

10.每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。

11. 20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。

12.弃上清，用70％的乙醇洗2次。

13.弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。

14.用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15.电泳检查DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。）

二、pBlueScriptII的双酶切消化

1.以如下体系进行EcoRI酶切：

pBSK(+)X µl（6µg）

ddH2O174-X µl

10×Buffer E  20 µl

混匀，加入限制性内切酶：

EcoRI （10U/ µl）6 µl  

总体积为200 µl。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3.37℃，水浴1hr。

4.加入200μl 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。

5.取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

6.取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

8.加入200μl 70％的乙醇洗沉淀。

9.4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

10.自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100μl ddH2O充分溶解沉淀。

11.加入以下试剂进行XhoI酶切：

ddH₂O                   74 µl

10×Buffer D               20 µl

XhoI （10U/ µl）  6 µl  

总体积为200 µl。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

13.37℃，水浴1.5hr。

14.加入200μl 1:1的酚/氯仿，混匀。

15.4℃，13000rpm，离心15min。

16.取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

17.取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

19.加入200μl 70％的乙醇洗沉淀。

20.4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

21.自然风干沉淀至无乙醇味，加入40μlddH₂O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。

三、载体去磷酸化

1.在40μl双酶切载体中加入以下试剂：

6μl   10×buffer

6μlCIAP（0.01U/μl）

8μl    ddH2O

总体积60μl。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3.37℃，水浴1hr。

4.70℃，15min，灭活酶。

5.电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。

四、载体效率检测

1.按以下所示作4个连接反应：

DNA 连接酶  

1 pBlueScriptII/E/X /CIAP    - 检测酶切效率

2 pBlueScriptII/E/X /CIAP    + 检测脱磷效率，载体自连效率

3 商品Vector加标准Insert    + 对照

4 自制Vector加标准Insert    + 检测载体效率

14℃连接过夜。

2. 各取1μl连接产物作电转化（具体流程见电转化）

3.计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。

第五部分 cDNA 双链和载体的连接：

一、连接：

根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，

即：insert/vector=1/3  incert/vector=1/1   insert/vector=3/1

按以下体系依次加入：

ddH₂O xμl

T4 ligase 10x buffer1μl

PBK(E/X)vector(20ng/μl)    1μl

cDNA (由浓度及连接比例而定)

T4 DNA ligase(3U/μl)1μl

 Total 10μl

14℃，连接过夜 

二、检测：（PCR方法）

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上

待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder

半小时后照相，观察胶图：insert、vector、阴性三个样品除了有少量引物带（大约在200bp左右）外，均无其他带形。阳性带形清晰。好的连接产物应在500

至4、5Kb大小之内形成一条清晰的smear。

第六部分 电转化流程

一、电转化感受态细胞的制备

1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）

2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。

4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油,  4℃，4000rpm，离心10min。

8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况，并记录。

二、连接产物纯化

1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:

10μl  of  ddH₂O

2μl  of  3M NaAC（PH5.2）

50μl of  无水乙醇

轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；

2.4℃，top Speed 离心30分钟；

3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

4.加入500μl70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；

5.4℃，top Speed离心5分钟；

6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；

7.加入10μlddH₂O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；

 

三、电转化

1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；

6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

四、电击杯清洗流程

1．  用清水将电击杯稍冲一下。

2．  向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3．  弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4．  加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

5．  弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。

6．  将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。

注：1．不同样品使用的电机杯应分开；

2．每周用1％酒精浸泡30分钟。

第七部分 快速鉴定、菌落PCR

一、质粒快速鉴定   

试剂：

Protoplasting buffer:

30mM Tris-HCl, pH8.00.33ml/1.0M

5mM EDTA   0.1ml/0.5M

50mM NaCl  0.1ml/5.0M

20% Sucrose5ml/40%

50µg/ml RNAseI    50ul/10mg/ml

50µg/ml lysozyme  50ul/10mg/ml

补水至10ml，-20℃分装保存。

Lysis buffer:

89mM Tris-HCl, pH8.0

89mM boric acid 2ml of 5×TBE

2.5mM EDTA

2% SDS   2ml of  10%

5% sucrose 1.25ml of 40%

0.04% bromphenol blue  4mg

补水至10ml，-20℃分装保存。

步骤：

1．将转化后的菌液铺平板，37℃过夜培养。

2．配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶。

3．用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 µl Photoplasting Buffer。

4．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer 的96孔板中，振荡混匀。

5．用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中，每孔4 µl，用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中（细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min），并点上Marker。

6．调节电压为20V（小槽）或40V（大槽），电泳15min，使细胞充分裂解，将电压调高到200V，继续电泳1hr，照相。

7．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

二、菌落 PCR

1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3μl的灭菌水。

2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。

3．依次加入：

10xbuffer     2.5

Mgcl2 (25mM)     1.8

DNTP(2.5mM)     1 

T3 引物（10pmol）    1

T7 引物（10pmol）    1 

Taq酶    0.4

total     25μl

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上。

4．94℃，2min。

5．94℃ 4分钟

94℃ 40秒

53.6℃    40秒 35个循环

72℃ 4分钟

72℃ 10分钟

4℃24小时

6．待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

7．将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。

第八部分 pBlueScript cDNA 库扩增

一、试剂及配方：

2 x LB （1升）：

20g    氯化钠

20g    蛋白提取物

10g    酵母提取物

加入蒸馏水至1升，用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌。

2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）

175ml  2 x LB液体

25ml   甘油（100％）

加入蒸馏水至200ml，压灭菌，置于4℃备用。

二、步骤

1.将cDNA文库转入大肠杆菌，如DH5a(DH10B)后，取少量菌液涂布氨苄平板，以推算克隆总量。

2.取一大小合适的三角瓶，根据克隆总量配制2 x LB液体，每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆，可以适当增加2 x LB液体的量，但不能少于此比例

3.按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose。

4.70℃加热搅拌至琼脂糖溶解，高压灭菌后再70℃搅拌30分钟。

5.37℃放置1小时。

6.加入适量安苄青霉素，使之终浓度为50ug/ml。

7.加入全部菌液，并轻柔旋转使之混匀，避免振荡。

8.将三角瓶置于冰水中1小时，水面必须没过三角瓶内液面。

9.轻轻取出三角瓶，30℃培养40-45小时。

10.将三角瓶内容物全部转入离心管中，离心10，000g ，20分钟，必须室温。

11.弃上清，每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB－甘油（12.5%）重悬。

12.将重悬液留下10ul检测滴度，其余分装于1.5ml离心管，-80℃冰箱内保存。

13.取1ul扩增后菌液倍比稀释。

14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养，次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数。