3. 彻底匀浆样品
细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁,就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。
对于某些样品来说,在匀浆之后,RNA提取之前,还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织,像脑组织和脂肪组织得到的裂解液,就需要通过氯仿抽提来去除脂类,从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖,会降低RNA的质量和产量,用Plant RNA Isolation Aid 预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。
6. DNase处理
如果提取的RNA将用于RT-PCR,我们推荐用DNase处理纯化的RNA样品以去除残留的DNA污染。当样品来源于富含DNA的组织,如脾脏时,DNase处理也是一个好办法。Ambion的RNAqueous-4PCR Kit的实验流程中包含了DNase处理的步骤,并提供了必需的试剂(DNA酶I)。
DNA-free DNase treatment & Removal Reagents 则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNase I,优化的反应缓冲液,和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法,无需使用有机溶剂和热处理。
为了得到完整的、高品质RNA,在整个RNA制备过程中,当RNA离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。
所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如RNaseZap或RNaseZap Wipes 来处理过。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。
纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀(加0.1体积的5 M 醋酸铵、2~2.5体积的无水乙醇,-20°C放置25分钟以上)可以很好地回收RNA。
如果需要定量回收低浓度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如糖原glycogen、酵母yeast RNA或linear acrylamide)的方法。
当RNA用于RT-PCR分析时,线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂,因为它们都不含DNA污染。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染,有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后,注意避免RNA沉淀过分干燥,因为这可能导致很难重新溶解。
许多RNA提取步骤的最后一步是溶解纯化的RNA沉淀。理想的重悬溶液应该满足3点要求:无RNase污染、较低的pH值(pH 6-7)、含有螯合剂,以保护RNA不受带入的RNase的降解。(THE RNA Storage Solution能满足以上所有标准)为了帮助溶解,RNA沉淀可置于重悬溶液中在65°C孵育5分钟,并不时轻摇以帮助溶解。
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