最近我正准备构建真核表达载体，涉及到在引物上添加酶切位点的问题，在园子里搜罗了好久，我把部分比较好的帖子整理了一下，欢迎大家补充或参与讨论（请求加分）。
一，关于带酶切位点引物的设计和选择,希望以下的建议能对你有所帮助:
1.要构建一个包含外源基因片段的质粒载体,所以在选择酶切上必须根据两方面共同选择:质粒多克隆位点区域包含的酶切位点以及您需要的外源性DNA片段上的酶切位点.
在设计引物的时候,你所加上去的酶切位点必须是质粒多克隆位点区域包含(一般多克隆位点区域包含的酶切位点在质粒上都是唯一的),而且在DNA片段上必须没有(否则您在酶切的时候就把DNA切断了),同时,一个很重要的是:你别让两个酶切位点的前后顺序弄反了.
2.如果设计条件比较宽裕的话(就是符合上述条件的酶切位点比较多),您在选择的时候最好是选择在质粒多克隆区域相隔较远的两个酶切位点,因为这样会有利于您在以后的酶切以及鉴定.
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/5258128_0.html
引物设计中酶切位点的问题.具体的步骤应该是这样:
1.先确定您选用的质粒上多克隆区域具有哪些酶切位点,再利用软件(例如:primer5)扫描您需要加入的DNA片段,把二者都有的排除掉,留下那些只在多克隆位点存在而DNA片段内没有的酶切位点.
2.然后通过第一步确定两种酶,然后设计引物.先按照普通引物的设计方法在您需要的DNA片段的起始密码之前以及终止密码之后设计一对引物,然后在正义引物的5`端加上位置靠前的酶切位点,在反义引物的3`端加入位置靠后的另外一个酶切位点.并最好在酶切位点之前再加上3个保护碱基.利用这样设计出来的引物去扩增您需要的DNA片段.
用DNAstar中的MapDraw看看你的目的基因的酶切图谱，有ABSENT SITS选项，可以看到目的基因中哪些酶切位点没有
关于引物设计酶切位点，如果引物较短或可以很简单能设计出目的基因中没有的酶切位点，就直接设计，
如果很复杂可以用软件，比如GeMS等，可以设计包含某些位点，不含某些位点等
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/5236912_0.html
酶切为点只需要一段一个就够了。但是你必须分清哪个加在上游，那个加在下游。然后加相应的保护碱基。
加酶切为点都是从引物的5‘端加的，最好引物方向都是5——3 ，这样就不用颠倒酶切位点。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/5587323_0.html
如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！
二，酶切:1.PCR产物的酶切
http://www.dxy.cn/bbs/thread/940309
PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:

PCR产物的酶切相关的帖子：
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/242899_1.html

http://www.dxy.cn/bbs/thread/818980

http://www.dxy.cn/bbs/thread/620693

http://www.dxy.cn/bbs/thread/720799

2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：
（1）酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：
（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:
http://circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html。
（B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？ 分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大 ；
（C）克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。

（2）酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。

（3）酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。

（4）酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！

(5）酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。

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祝您实验顺利!梦想成真！谢谢