实验方法

慢病毒包装简要程序

2015-03-23 15:34

以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×106个293FT细胞。

1、取1.5 ml灭菌EP管,加入1.5 μg包装混合质粒和0.5 μg表达质粒以及250μl的无血清Opti MEM。轻柔混匀,室温孵育5 min。

2、取1.5 ml灭菌EP管,取9μl 脂质体2000l溶于250 μl无血清Opti-MEM I培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。

3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20 min。

4、用胰酶消化并记数293FT细胞。用含血清的DMEM培养基重悬细胞。

5、在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。

6、将1ml重悬的293FT细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37℃ CO2孵箱中孵育过夜。

7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。

7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20 min,去除沉淀。

8、病毒上清-80°C贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

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来源:丁香园

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