使用Clontech公司的In-Fusion PCR Cloning Kit快两年了，在此谈谈心得。

早期的In-Fusion PCR Cloning Kit是干粉，现在已经发展成为试剂盒，两种我都用过。

此方法最大的优点就是不用考虑插入片段的正反性，只要链接成功就是阳性克隆。

但是有时候链接效率低，比较不容易得到阳性克隆，因为我没有使用同类的其他链接方法，所以也不知道两者比较起来如何，但是据我的老师说这个方法效率高。

在整个过程中，我觉得应该注意的有以下几点：

1 载体的酶切效率。此法需要使用两种内切酶，为了考虑后期实验的方便性，通常会选择一个酶切效率高的酶比如说BamH1 EcoR1，另一个效率相对较低的，比如说Not 1， Kpn1。这四种我都用过，如果buffer不一样的，可以先切效率低的再切效率高的，中间切胶纯化。

当然酶切效率跟载体本身结构也有关系，我用过的载体有pGBKT7，pGADT7，pEF4VH，pSeqTaq，Prolabel，pAcGFP，pTRE。其中pTRE没有成功过。

2 插入片段的处理 使用高保真的酶扩增插入片段，我用过TaKaRa的primesSTAR GXL DNA Polymerase另一种是Clontech的Advantage HD Polymerase。一般都进行切胶回收，用得QIAGEN的kit。Clontech公司在换新的Kit时曾经赠送过一种胶回收纯化试剂盒NucleoSpin Extract，个人感觉这个效率比QIAGEN的高，而且后期不需要酒精PPT纯化。

3 载体和插入片段的纯度，如果第一次没有成功，可以对插入片段使用酒精沉淀进行纯化，通常纯化过后就可以得到阳性克隆。Prolabel，pAcGFP这两个载体是试剂盒配的，链接效率相当高，其他的都是自己扩增的，效率相对低很多。

4 载体和插入片段的比率 可能和不同的载体，以及插入片段的长度有关，说明书有相应的建议比率，个人认为1kb以下的片段链接效率比较高，2kb以上的就比较低了，当出现链接不成功的情况，就可以提高插入片段的量，比如说2：1的提高到3：1。

5 感受态细胞 使用高感受态细胞，高感受态的DH5，我使用的是新鲜准备的XL1－BLUE cells。为了获得更多的阳性克隆，通常会使用两个培养皿，几乎全部的感受态细胞。