:(各位大侠:
小弟最近做克隆实验遇到很大的障碍,已经连续三次失败了。请各位大哥帮助分析原因,小弟不胜感激!
我克隆的是一个肿瘤标志物的基因片段,长约150bp 。具体过程如下:
一, 普通PCR,电泳,切下特异条带;
二, 用QiaGene公司胶回收试剂盒提取特异条带DNA,所得胶回收产物约30ul。取2ul做荧光定量PCR(该方法条件优化已完成),证实胶回收产物中目的片段含量很高。
三, 用上海生工的PUCm-T载体试剂盒完成连接反应。按说明书操作,反应过夜。
四, 感受态细胞的制备:
1, 把DH5菌种分别接种在含氨卞的LB平板和不含氨卞的LB平板上,培养16-18小时。结果在不含氨卞的LB平板上DH5菌长出单个菌落,而在含氨卞的LB平板上无可见菌落生成,证明DH5菌未被杂菌污染;
2, 挑取单个菌落接种于2ml不含氨卞的LB肉汤,37度,150rpm,,振荡培养过夜;
3, 取上述0.2ml菌液接种于30ml不含氨卞的LB肉汤,37度,150rpm,,振荡培养3小时,使其OD600=0.4;
4, 将上述培养物转入40ml离心管,冰浴10分钟;
5, 低温离心机4,2500rpm离心10分钟,弃上清;
6, 用25ml 0.1M CaCl2溶液重悬,冰浴20分钟;
7, 低温离心机4,2500rpm离心10分钟,弃上清;
8, 用800ul 0.1M CaCl2溶液重悬沉淀,冰浴30分钟;
五, 转化反应:
1, 每管连接反应产物(10ul)加入感受态细胞100ul, 冰浴30分钟;
2, 热休克:42度,90秒;
3, 马上冰浴5分钟;
4, 各管分别加入0.8ml 不含氨卞的LB肉汤, 37度,100rpm,,振荡培养1小时;
5, 各管培养物用低温离心机4,2500rpm离心10分钟,留取上清约200ul,混匀,分别在含氨卞的LB平板(已涂布X-Gal和IPTG)上涂布均匀;
6, 37度培养过夜(16-18小时);
六, 蓝白斑筛选:
1, 挑取白色,奶油样单个菌落7到8个,分别接种于3ml含氨卞的LB肉汤, 37度,150rpm,,振荡培养过夜;
2, 每管培养物取1.5ml,用上海生工的“小量质粒DNA抽提试剂盒”提取质粒DNA;
3, 取2ul质粒DNA做荧光定量PCR,证实产物中目的片段含量很低。
各位大哥,如能指出我上述操作中的不当之处,无疑是雪中送炭。小弟先向您致谢了!
小弟最近做克隆实验遇到很大的障碍,已经连续三次失败了。请各位大哥帮助分析原因,小弟不胜感激!
我克隆的是一个肿瘤标志物的基因片段,长约150bp 。具体过程如下:
一, 普通PCR,电泳,切下特异条带;
二, 用QiaGene公司胶回收试剂盒提取特异条带DNA,所得胶回收产物约30ul。取2ul做荧光定量PCR(该方法条件优化已完成),证实胶回收产物中目的片段含量很高。
三, 用上海生工的PUCm-T载体试剂盒完成连接反应。按说明书操作,反应过夜。
四, 感受态细胞的制备:
1, 把DH5菌种分别接种在含氨卞的LB平板和不含氨卞的LB平板上,培养16-18小时。结果在不含氨卞的LB平板上DH5菌长出单个菌落,而在含氨卞的LB平板上无可见菌落生成,证明DH5菌未被杂菌污染;
2, 挑取单个菌落接种于2ml不含氨卞的LB肉汤,37度,150rpm,,振荡培养过夜;
3, 取上述0.2ml菌液接种于30ml不含氨卞的LB肉汤,37度,150rpm,,振荡培养3小时,使其OD600=0.4;
4, 将上述培养物转入40ml离心管,冰浴10分钟;
5, 低温离心机4,2500rpm离心10分钟,弃上清;
6, 用25ml 0.1M CaCl2溶液重悬,冰浴20分钟;
7, 低温离心机4,2500rpm离心10分钟,弃上清;
8, 用800ul 0.1M CaCl2溶液重悬沉淀,冰浴30分钟;
五, 转化反应:
1, 每管连接反应产物(10ul)加入感受态细胞100ul, 冰浴30分钟;
2, 热休克:42度,90秒;
3, 马上冰浴5分钟;
4, 各管分别加入0.8ml 不含氨卞的LB肉汤, 37度,100rpm,,振荡培养1小时;
5, 各管培养物用低温离心机4,2500rpm离心10分钟,留取上清约200ul,混匀,分别在含氨卞的LB平板(已涂布X-Gal和IPTG)上涂布均匀;
6, 37度培养过夜(16-18小时);
六, 蓝白斑筛选:
1, 挑取白色,奶油样单个菌落7到8个,分别接种于3ml含氨卞的LB肉汤, 37度,150rpm,,振荡培养过夜;
2, 每管培养物取1.5ml,用上海生工的“小量质粒DNA抽提试剂盒”提取质粒DNA;
3, 取2ul质粒DNA做荧光定量PCR,证实产物中目的片段含量很低。
各位大哥,如能指出我上述操作中的不当之处,无疑是雪中送炭。小弟先向您致谢了!
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