实验方法

师弟问了我 25 个引物相关的问题

2014-06-03 00:00

1.      引物是如何合成的?


目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公司生产,而 Bioneer自行研制 的专利 384并行高通量 DNA合成仪, 可实现 99% 的高合成率。无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的,合成的方向是由待合成引物的 3′ 端向 5′ 端合成的,相邻的核苷酸通过 3′→5′ 磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其 5′- 羟基的保护基团 DMT ,获得游离的 5′- 羟基。

第二步,合成 DNA 的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的 3′ 端被活化, 5′- 羟基仍然被 DMT 保护,与溶液中游离的 5′- 羟基发生缩合反应。

第三步,带帽 (capping) 反应,缩合反应中可能有极少数 5′- 羟基没有参加反应 ( 少于 2%) ,用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5′- 羟基上的保护基团 DMT ,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理,连接在 CPG 上的引物被切下来,通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物,成品引物用 C18 浓缩、脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定 OD260 定量,根据定单要求分装。

2. 引物纯化方式有哪些,如何选择?

◆ 脱盐

寡核苷酸合成后,为了纯化寡核苷酸成为天然的 DNA 结构,首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理,合成的寡核苷酸从固相载体上分离, 2- 氰乙氧基--磷酸二脂键的保护基团,以及碱基的保护基团基(苯甲酰基和异丁基)被去除,从而形成了天然的 DNA 结构。然而,必要的去保护步骤完成后,寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质,但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而,脱盐的寡核苷酸还是能够满足PCR检测等基础生物研究。

◆  BioRP / OPC 纯化

如果寡核苷酸以 “ 三苯甲基 ” 的形式合成,则 N- 甲基寡核苷酸包含5’-DMT 基团,提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为 DMT 基有强的亲脂的特性,有5’-DMT 基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性,因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’- DMT 寡核苷酸存在强亲和力,但是提前终止的寡核苷酸不包含 DMT 基团,所以,我们能够成功的把想要的 N- 甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。

◆  HPLC

如果合成的寡核苷酸应用于克隆,定向诱变或定量的基因探测,那么对其纯度要求较高。脱盐或 OPC 纯化的寡核苷酸可能达不到要求,则 HPLC 纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂,阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的 HPLC 通常显示 95-98% 纯化效率,对于达到 35-mer 寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的 HPLC 与阴离子交换树脂的 HPLC 呈现相似的纯化效率。因为 HPLC 的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度,用 HPLC 法不能有效纯化长的寡核苷酸(大于 35-mer) 。

◆  PAGE

对于长的寡核苷酸的纯化( 50-100mer ),我们推荐 PAGE 纯化法,它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶 ( 电泳 ) 作为纯化基质。尽管 PAGE 显示出高的纯化效率(> 98% ),但它在额外的步骤方面有一些缺陷,比如在 PAGE 之后需要提取和脱盐,继而将导致纯化产率的下降。

3. 引物的 OD 数如何定量?

答:引物合成引物 OD 数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长 260nm ,石英比色杯,光程为1 厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。

4. 需要什么级别的引物?

答:引物常用的纯化方式脱盐、 BioRP / OPC 纯化、 PAGE 纯化、 HPLC 纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用

引物长度要求

纯度级别要求

一般 PCR 扩增

<45 base

BioRP / OPC

一般 PCR 扩增

>45 base

PAGE

诊断 PCR 扩增

< 40base

BioRP / OPC , PAGE

DNA 测序

20base 左右

BioRP / OPC

亚克隆,点突变等

根据实验要求定

BioRP / OPC , PAGE , HPLC

基因构建(全基因合成)

根据实验要求定

PAGE

反义核酸

根据实验要求定

PAGE

修饰引物

根据实验要求定

PAGE, HPLC

5. 最长可以合成多长的引物?

答:引物越长,出现问题的概率就越大。有的公司合成过 120base 的引物,产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过 80mer ,按照目前的引物合成效率, 80mer 的粗产品,全长(还不一定正确)引物的百分比不会超过 40% ,后续处理还有丢失很多,最后的产量很低。

6. 需要合成多少 OD 数?

答:根据实验目的确定。一般 PCR 扩增, 2 OD 引物,可以做 200-500 次 50ul 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接, 1 OD 就足够了。但是有些研究人员,就做几次 PCR ,但是却要 5-10 OD 。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高 OD 数。片段越长 , 最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足,总觉得需要重复多次才能成功。

7. 如何检测引物的纯度?

答:实验室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD 的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性 (95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。 600V 电压进行电泳,一定时间后 ( 约 2-3 小时 ) ,剥胶,用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用 EB 染色或银染方式染色。

而有的厂家提供 Maldi-TOF质谱 QC质量控制,从而保障了合成的准确率 :

Bioneer 使用多重 Maldi-TOF 质谱仪进行全自动装载及监测。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。 Bioneer 是世界上仅有的几个对生产的每份核苷酸 ( 单个寡核苷酸和高通量和成 ) 都用 MALDI-TOF 质谱仪检测进行核苷酸 QC 检测的厂商,而且免费提供质谱数据。

8. 如何计算引物的浓度?

答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 一般情况下,建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul ,加水的体积(微升)按下列方式计算: V ( 微升 )= OD 数 * (乘) 33 * (乘) * (乘) 20000 / ( 除 ) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。

注意: 1 OD260= 33 ug/ml.

9. 如何计算引物的 Tm 值?

答:引物设计软件都可以给出 Tm ,与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为 25mer 以下的引物, Tm 计算公式为:

Tm =            4℃   (G + C)+            2℃   (A + T)

对于更长的寡聚核苷酸, Tm 计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中, Size = 引物长度。

Tm 的定义: Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

10. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的 ?

答:非修饰的引物的 Molecular Weight 在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为 324.5 ,引物的分子量 = 碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算 MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +( Nx * Wx ) +( Ni* Wi) +16* Ns- 62.

NA, NG, NC, NT, Ni 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量, WA, WC, WG, W, Wi 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量, Nmod , Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如 G+A 混合的分子量为( 313.21+329.21 ) /2 = 321.21 。 Ns 为硫代数目,硫代每个位置增加分子量 16 。

常规碱基分子量:

Base

Molecular Weight

A

313.21

C

289.18

G

329.21

T

304.19

I

314.2

U

290.17

常规修饰基团分子量

修饰基团

分子量


修饰基团

分子量

5’-Biotin

405.45

3’-TAMARA

623.60

5’-(6 FAM)

537.46

3’-Dabsyl

498.49

5’-HEX

744.13

3’-(6 FAM)

569.46

5’-TET

675.24

3’-Amino Modifier C3

153.07

5’-Cy5

533.63

3’-Amino Modifier C7

209.18

5’-Cy3

507.59

3’-Thiol Modifier C3

154.12

11. 如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或            10mM Tris pH7.5 缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的 pH 值比较低( pH4-5 ) , 引物在这种条件下不稳定。

12. 如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。溶解后的引物 -20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的 OD 数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

13. 合成的引物5'端是否有磷酸化

答:合成的引物            5'    为羟基,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行 5′ 端磷酸化,或者要求引物合成公司合成时直接在 5′ 或 3′ 端进行磷酸化,需要另外收费。

14. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应需要引物的            5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。 SiRNA 分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。

15. 测序发现引物有突变是怎么回事?

答:测序发现引物区域有突变,特别是 40 个碱基以下的引物 , 发生的概率不大,但是肯定也会发生。用户一般可以放心,引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列 COPY 到合成仪的,碱基输错的机会不多。核酸合成公司一般会有一套控制办法,预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释,人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样,采用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似,没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高也就是 99% ,副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失 DMT, 导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变,一般认为是一般认为是带帽 (capping) 反应不彻底造成的, Caping 反应主要是封闭极少数 5′- 羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能 100% 脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在 G 转换成其它碱基。碱基 G 在一定条件下可以转化为烯醇异构体 (脱嘌呤), 2,6 diaminopurine , DNA 复制和扩增过程中 DNA 聚合酶将 2,6 diaminopurine 看作碱基 A ,测序就会发现碱基 G-A 置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基 G 或 A 的缺失。

引物合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在,有不少降低发生的频率建议和措施,但是这些措施还停留在实验室阶段,还没有能够应用到规模化生产中。

16. 长链引物为什么出错的几率非常高?

答:引物合成时,每一步反应效率都不能达到 100% ,产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如 PCR 扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证 100% 正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶 PCR 扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

17. 如果测序发现突变,该如何处理?

答:遇到这种情况,首先和核酸合成厂家取得联系,生产人员会检查生产的原始记录,主要是核对合成序列是否和定单一致,他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下,建议重新挑取克隆测序,可能会找到正确克隆的。根据经验, 40 个碱基以下的引物,测 1-2 个克隆就可以了; 40 个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了。一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次,不过重合的引物和第一次的引物一样,都可能含突变,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中,如果发现一段区域突变点不多,就多测几个,否则就重合一下引物。

18. 引物是经过 PAGE 纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

答:理论上分析型 PAGE 变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备 PAGE 电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象, PAGE 纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少 OD 数,引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么?

答:下列原则供您参考。
◆ TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物 50-150bp ),但不能与引物重叠。
◆ 长度一般为 18-40mer 。
◆ G-C 含量控制在 40-80% 左右。
◆ 避免连续相同碱基的出现,特别是要避免 GGGG 或更多 G 出现。
◆ 在引物的5'端避免使用 G 。
◆ 选用比较多的碱基 C 。
◆ 退火温度 Tm 控制在 68-            70C   左右。

有用的荧光染料参数

Name

吸收波长

发射波长

colors

6-FAM ( 6-carboxy-fluorescein )

494nm

518nm

Green

TET   ( 5-tetrachloro-fluorescein )

521nm

538nm

Orange

HEX ( 5-hexachloro-fluorescein )

535nm

553nm

Pink

TAMRA ( tetramethyl-6-carboxyrhodamine )

560nm

582nm

Rose

ROX ( 6-carboxy-x-rhodamine )

587nm

607nm

Red

Cy3   ( Indodicarbocyanine )

552nm

570nm

Red

Cy5 ( Indodicarbocyanine )

643nm

667nm

Violet

20.Primer 设计的基本原则是什么?

答:引物设计的下列原则供您参考。
◆ 引物长度一般在 18-35mer 。
◆ G-C 含量控制在 40-60% 左右。
◆ 避免近          3'    端有酶切位点或发夹结构。
◆ 如果可能避免在          3'   端最后 5 个碱基有 2 个以上的 G 或 C 。
◆ 如果可能避免在            3'    端最后 1 个碱基为 A 。
◆ 避免连续相同碱基的出现,特别是要避免 GGGG 或更多 G 出现。
◆ 退火温度 Tm 控制在 58-            60C    左右。
◆ 如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。

21. 为什么引物的 OD260/OD280 小于 1.5 ?

答:引物应该全是 DNA ,但是 OD260/OD280 的比值为什么那么低,怎么会有蛋白质污染?引物化学合成,哪里有机会污染到蛋白质?需要指出的是OD260/OD280 的比值不能用来衡量引物的纯度。 OD260/OD280 的比值过低一般是由于引物中 C/T 的含量比较高所致。下表是一个 20mer 同聚体引物的 OD260/OD280 的比值,清楚表明 OD260/OD280 的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

Base Composition

A260/280

5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3

2.50

5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3

1.85

5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3

1.15

5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3

1.14

5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3

1.66

22. 同样的 OD 用 PAGE 检测, EB 染色为什么深浅不一?

答:通常可以用 EB 染色的方法来判断双链 DNA 的量 ( 如质粒 DNA) ,因为 EB 可以嵌合到双链 DNA 中。而合成的单链 DNA ,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同, EB 的染色程度也会有差异,比如 Oligo(dT) 等不形成二级结构, EB 染色效果就非常差。所以不要用 EB 染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用 EB 染色来照片不适合所有引物。

23. 引物不纯会有什么后果?

答:引物不纯可能会导致: 1) 非特异性扩增; 2) 无法用预先设计在引物 5′ 端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物; 3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24. 已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好 了?

答:如果溶解引物的水 PH 过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mMT ris pH7.5 缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的 pH 值比较低( pH4-5 ) , 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是 PCR 使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

25.PCR 扩增不出就引物有问题吗?

答:基本不是。当今发展出各色各样的 PCR 扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决 PCR 扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式 PCR 就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增 , GC 含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见:

( 1 ) RT-PCR 。请注意,很多基因通过常规 RT -PCR 方法是很难扩增出来的。 RT- PCR 成功的关键在于 RT 的反应的 RNA 质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。

( 2 )从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组 DNA 过高,会影响反应体系中的 Mg 和 pH


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来源:互联网 编辑:北京力途科技有限公司

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