:)各位大虾帮帮忙，用绿色荧光蛋白以及neo构建载体，转染牛成纤维细胞后，开始是绿色荧光还很亮，可是G418筛选一段时间后，会荧光会越来越弱，到最后筛出单克隆，也几乎没有有荧光的单克隆了。原因是什么？有好的解决办法吗？谢谢各位 ！！
绿色荧光蛋白用的cmv启动子。

1.开始时的荧光很强，这个很好解释，因为开始时未进行G418筛选，所以发绿色荧光的细胞有两部分，一是未稳定整合的，一是稳定整合的，所以开始时亮度要高。
2.为什么筛选后单克隆无荧光：首先，经过G418筛选，外源质粒不能整合入染色体的细胞死亡；其次，稳定整合的细胞外源质粒整合的位置存在位置效应，即整合于不利于外源基因表达的位置，从而使外源基因沉默；第三，我不知道你的质粒中是否加入了核糖体进入位点序列，如果有的话，研究显示该位点前后的基因表达水平存在不同，可以查查相关文献
3.有无好的办法：我认为没有，稳定转染筛选时有运气的成分，假如外源质粒恰好整合到了利于表达的染色体部位，这时筛选出的克隆才有高表达。当然也有另外一种情况，虽然外源质粒整合到了利于表达的染色体部位，但细胞状态不佳，会导致该细胞在后期筛选中死亡，毕竟培养过程中的影响因素有时是说不清的。

谢谢了！我会在看看文献！