预期应用

本试剂盒运用双抗体夹心 ELISA 法定量测定人组织匀浆、细胞裂解液和其他生物液体中 IL8Ra 含量。

试剂盒内容

试剂名称	数量	试剂名称	数量
96孔板(预包被)	1	96孔板覆膜	2
标准品	2	标准品稀释液	1×20mL
检测溶液A	1×120μL	检测稀释液A	1×12mL
检测溶液B	1×120μL	检测稀释液B	1×12mL
TMB底物	1×9mL	终止液	1×6mL
浓洗涤液(30×)	1×20mL	使用说明书	1

需自备的设备及试剂

1.450±10nm 滤光片的酶标仪 （建议仪器使用前提前预热）

2.单道或多道微量加液器及吸头

3.稀释样品的 EP 管

4.蒸馏水或去离子水

5.吸水纸

6.盛放洗液的容器

标本的采集与保存

1. 组织匀浆：

1）取适量组织块，于预冷 PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；2）可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入 5-10 mL 预冷 PBS 进行充分研磨，该过程需在冰上进行（有条件实验室可选用机器匀浆）；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融 进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次）。

3）将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。

2. 细胞裂解液：

1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）；2）将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次；

3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：

i 超声破碎：取适量 PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。

ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20oC 以下冰冻，室温融解，反复 3 次，使细胞溶胀破碎。

4）将标本于 2-8oC 1500×g 离心 10 分钟，收集上清备用。

3. 其它生物标本：

请 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

注意：

1. 以上标本均需密封保存，4oC 保存应小于 1 周，-20oC 不应超过 1 个月，-80oC 不应超过 2 个月。

2. 标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。

3. 标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

试剂准备

1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温 （18-25oC），试剂不能直接在 37oC 溶解。

2.标准品 （冻干品）：每瓶标准品加入标准品稀释液 1 mL，盖好后室温静置大约 10 分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 10ng/mL。准备 7 个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 500μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成 10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，标准品稀释液 （0ng/mL） 直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

操作步骤

1.加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔 7 孔，依次加入 100μL 不同浓度的标准品 （见试剂准备 2）。空白孔加 100μL（见试剂准备第二步最后一管），余孔加待测样品 100μL，酶标板加上覆膜，37oC 温育 2 小时。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。

3.每孔加检测溶液 A 工作液 100μL（临用前配制），酶标板加上覆膜，37oC 温育 1 小时。

4.弃去孔内液体，每孔用 300μL 的洗涤液洗涤，浸泡 1-2 分钟，吸去 （不可触及板壁） 或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次 （也可轻拍将孔内液体拍干），重复洗板 3 次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。

5.每孔加检测溶液 B 工作液 （临用前配制）100μL，加上覆膜，37oC 温育 1 小时。

6.弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 4。

7.每孔加底物溶液 90μL，酶标板加上覆膜，37oC 避光显色 （反应时间控制在 15-25 分钟，不要超过 30 分钟。当标准孔的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显时，即可终止）。

8.每孔加终止溶液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9.在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度 （O.D. 值）。

注意：

1.试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。

2.加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的「预温育」时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间 （包括标准品及所有样品） 最好控制在 10 分钟内。推荐设置复孔进行实验。

3.温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4.洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。

5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化 （比如，每隔 10 分钟观察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

6.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

7.如果实验室内湿度低于 60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。

3.检测溶液 A 及检测溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液 A 或 B1:100 稀释 （如：10μL 检测溶液 A/990μL 检测稀释液 A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制 （100μL/孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2 mL。

4.浓洗涤液：用 580 mL 蒸馏水或去离子水将 20 mL 浓洗涤液稀释至 600 mL，进行 30 倍稀释。

5.底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的 TMB 至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回 TMB 瓶中。

注意：

1、 标准品的稀释不能直接在板中进行。

2、 标准品请于临用前 15 分钟内配制。该标准品只能使用一次。

3、 标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液请使用相应的稀释液配制，不能混淆。混匀时要轻轻充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确请使用微量吸管，并校准微量加液器。请依据所需的量精确配制，尽量不要微量配制 （如吸取检测溶液 A 时，一次不要小于 10μL），以避免造成浓度误差。

4、 请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液 A 工作液和检测溶液 B 工作液。

5、 浓洗涤液中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶完全溶解再进行配制。

6、 试剂盒中部分试剂为储存液，客户需配置成工作液后使用，在配置过程中如因纯净水质量差或水质污染，以及实验中所用耗材洁净度差，可能造成实验结果不准确，甚至完全错误，请使用双蒸水。

典型数据

为了便于计算，尽管浓度为自变量而 O.D. 值为因变量，我们绘图时仍采用标准品的 O.D. 值作为横坐标 （X 轴），标准品的浓度为纵坐标 （Y 轴）。同时为了试验结果的直观性，图中提供的是原始数据而非对数值。推荐使用对数 值建立标准曲线图。由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和温度条件等），标准曲线的 O.D. 值会有所差异。所提供的标准曲线仅供参考，实验者需要根据自已的实验建立标准曲线。

人白介素 8 受体α（IL8Ra） 检测试剂盒标准曲线检测范围

0.156-10ng/mL

最低检测限

0.072ng/mL 此值为 20 个空白样品 （即标准品稀释液） 测定的平均值加二倍标准差所对应的浓度。

精密度

精密度用样品测定值的变异系数 CV 表示。CV（%） = SD/mean×100批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测， 每份样本连续测定 20 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批间差：选取 3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复测定 8 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批内差： CV<10%

批间差： CV<12%

实验流程

1.实验前标准品、试剂及样本的准备；

2.加样（标准品及样本）100μL，37℃ 孵育 2 小时；3.吸弃，加检测溶液 A100μL，37℃ 孵育 1 小时；4.洗板 3 次；

5.加检测溶液 B100μL，37℃ 孵育 1 小时；

6.洗板 5 次；

7.加 TMB 底物 90μL，37℃ 孵育 15－25 分钟；

8.加终止液 50μL，立即 450nm 读数。

警告

本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

You can reference link of the kit as following

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-il8ra-hu.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-il8ra-mu.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-il8ra-ra.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-il8ra-rb.html