1.获得特定脑组织。

2.获取单细胞悬液通常有两种方法。机械分离法操作步骤：

①用少量DF12液体覆盖组织，再用虹膜剪剪碎组织块成 1 mm³大小；

②将组织块收集入神经干细胞培养液中；

③用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液；

④细胞悬液过200目筛网；

⑤离心800r/min,3min,弃上清。

胰酶消化＋胰酶抑制剂终止法操作步骤：

② 用虹膜剪剪碎组织块成1mm³大小；

②用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化组织，37℃-2min;

③加入胰酶抑制剂终止消化（使用浓度因生产公司不同、抑制剂活性不同而不同，可参考具体说明书）；

④800r/min离心3min,弃上清。

3.用神经干细胞培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种，密度为1x10⁵/ml。

4.培养3-4d可以1/2量换液，培养7-10d进行传代。程序：切收集神经球入离心管，800r/min离心3min;

(2)弃上清，加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化组织，37℃孵育3-Smin;

＠加入等体积的1X胰酶抑制剂终止消化；

＠收集细胞入离心管中，800r/min离心3min,弃上清；

＠加入新的神经干细胞培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种。

5.培养的神经球可以接种于多聚赖氨酸包被的皿底或玻片上，加入神经干细胞分化液分化诱导，使其向子代细胞分化。由于神经千细胞悬浮培养的方法实际上是回顾性的判断细胞的身份，即只有能够持续传代增殖并向多种方向分化的细胞才是真正的神经于细胞，因此，结果的判读就要结合多种方法综合判断。进行实验的时候也需要通过对照的设置来保证实验的可信度。具体方法如下：

1.形状：

如图1-8,神经干细胞克隆增殖所获得的球体一般形状圆滑，质地紧密，细胞聚集体一般松散而不规则。

2．免疫.细胞化学染色：

如图I-9,Nestin是神经干细胞的标志物，可以通过Nestin免疫荧光染色来进行鉴定。:

3.自我更新能力：

严格的神经于细胞实验可以通过3-5次传代来获得纯度较高的NSC。

4.分化潜能：神经球分化后可以用神经元标记物、星形胶质细胞标记物(GFAP)、少突胶质细胞标记物(PDGFR)等来进行子代细胞的免疫荧光染色，判断所得到的细胞是否具有多向分化潜能。

1.要注意区分细胞聚集体和克隆球体，可以根据上述结果判读方法进行。

2细胞增殖能力与组织来源动物的年龄以及所取脑区都有很重要的关系。胎龄越小干细胞所处发育状态越幼稚，细胞的增殖能力越强；皮层来源的神经干细胞相比其他脑区更容易获得增殖能力较好的细胞。

3.脑膜组织对于神经干细胞有诱导贴壁和分化的作用，所以，组织处理过程中一定要清除干净脑膜组织等。

4血清对千神经干细胞有诱导分化的作用，所以终止消化时不能使用加有血清的培养液。

5传代的时间一般为7-10d左右，但是如果神经球的体积较大，光镜下观察其中心已经开始出现黑色区域（产生黑色区域的原因可能是因为球体体积过大，影响光线透过，但是此时球体中心也往往会出现死细胞），则要及时传代。

1.机械法分离获得的细胞容易有细胞聚集，培养得来的球体就有可能不是单细胞克隆体；而消化法的消化液浓度和时间则要根据组织来源动物的不同年龄以及组织来源的不同区域进行调整，摸索最佳消化浓度和时间。

2.由于神经干细胞贴壁后也具有一定的促使分化的作用，所以，培养神经干细胞的皿或瓶最好用新的无划痕的器皿。

3如果观察到培养过程中出现贴壁细胞，可以通过更换培养瓶的方法来进行挽救，并且发现后越早更换越好。但是如果球体还没有形成，则尽量不要更换器皿和触碰细胞，否则会影响神经球的形成。

 参考《神经生物学实用实验技术》第四军医大学出版社