基本方案
实验原理
实验材料
试剂/试剂盒
仪器/耗材
实验步骤
原代培养来自于新生7d的SD大鼠小脑颗粒神经元,可参考Moreno-Flores的方法,此方法培养的小脑颗粒神经元纯度达到95%以上。具体操作过程如下。
1.首先依照总论的方法获得细胞悬液,然后在离心获得的细胞沉淀中,加入少量的完全培养液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重悬细胞,再根据细胞计数的结果补加适最的完全培养液。根据培养目的按照合适的密度接种细胞于多聚赖氨酸包被的介质上,37℃,5%CO2的孵育箱内培养。
2.细胞培养第4天1/2量换液,至第7天细胞基本成熟。小脑颗粒神经元胞体小,接种后约24h,开始伸出突起,突起易成束生长。图I-2示接种48h后细胞生长情况。
注意事项
1.在原代取材时,由于取材部位和仔鼠体积的原因,通常将消过毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中,直接用解剖器械取出完整的小脑,不做断头处理。
2.小脑的脑膜不易剥离干净,要特别仔细去除,否则培养物中成纤维细胞的污染难以去除。
3.由于培养细胞的目的不同,接种时的密度就有区别。如用于神经突起观察,可接种(1-3)x105/cm2的密度;如用于凋亡诱导的研究,可接种(4-6)x105/cm2的密度。
4.在做凋亡诱导时,通常将含高钾的培养液全量换液为不含额外添加KCl的普通Neurobasal+B27培养液即可。按照核固缩判断的方法,8h后凋亡的细胞数量可达40%左右。
其他
1小脑颗粒神经元胞体小,突起细长,且容易成束生长,个人感觉该细胞可做突起生长的大致观察,并不适合利用软件分析突起长短。神经元一般3-4d突起就可长好,可开始观察。
2.在体外培养7d左右待细胞成熟后,可以开展凋亡实验。如添加保护剂抑制凋亡,应注意诱导凋亡的时间不可过长,否则可能导致保护实验失败。